Техники окрашивания: Современные техники окрашивания волос. — aleks-school — Premier Style

Содержание

Современные техники окрашивания волос. — aleks-school

Окрашивание волос – один из беспроигрышных способов создания нового образа. Такое решение позволит выглядеть более свежо и стильно. Кроме того, данная процедура необходима тем, кто имеет невыразительный натуральный цвет волос или же просто хочет поэкспериментировать.

На данный момент используется ряд современных техник, которые позволяют минимизировать вред процедуры и сохранить здоровые волосы. В этом году есть несколько основных трендов окрашивания, которые помогут выглядеть стильно.

Стоит отметить, что сейчас в моде сочетание нескольких оттенков, а также создание их плавных переходов. Такие решения – интересная альтернатива классическому однотонному окрашиванию. Девушкам предлагается огромный выбор техник, с помощью которых можно с легкостью создать неповторимый образ.

Главное в этом вопросе – найти хорошего мастера, который не только поможет подобрать оптимальный вариант, но и выполнит процедуру максимально качественно.

Основные модные техники

В этом году особенно модным считается создание контраста за счет сочетания более светлых и более темных прядей. К основным техникам окрашивания можно отнести:

Балаяж. Такой способ позволяет создать эффект выгоревших прядей – в результате получается очень естественная прическа. Для этого создаются переходы более светлых и темных оттенков. Тона подбираются в зависимости от цвета волос. При этом такие переходы не имеют заметной границы и отличаются плавностью.
Скандинавский поинт. Данная техника является разновидностью блондирования и подразумевает создание плавного перехода холодных светлых оттенков на макушке к теплым на кончиках.
Мелирование. Сама по себе эта техника давно вышла из моды и даже считается проявлением плохого вкуса. Однако современные способы мелирования подразумевают последующее тонирование, которое позволяет создавать стильные оттенки волос. В этом году особенно модными считаются пудровые, голубые цвета. При этом внешний вид получается более мягким и естественным.
Омбре. Считается одним из наиболее модных трендов – в этом случае создается плавный переход темного цвета шевелюры к светлому или же наоборот. Такое решение одинаково хорошо подходит как блондинкам, так и брюнеткам. При окрашивании используется множество оттенков одного цвета, которые сочетаются по принципу градации.

Помимо этого, можно выделить технику колорирования, которая также актуальна в этом сезоне. В данном случае используется хаотичное сочетание прядей различных оттенков. Причем цвет может быть как максимально естественным, так и ярким.

Эффекты современных техник окрашивания

Окрашивание – процедура, к которой прибегают не только для смены имиджа или создания нового образа. С его помощью также можно успешно скрыть ряд недостатков. Дело в том, что главной особенностью современных техник является тщательная прокраска каждой пряди, для которой выбирается собственный оттенок. По этой причине в результате получается цвет с множеством плавных переходов. Данную особенность можно использовать для создания таких эффектов:

Увеличение объема. Использование переливов из различных оттенков поможет сделать волосы зрительно более густыми. Для выполнения такой задачи отлично подходит мраморное окрашивание, а также балаяж.
Подчеркивание длины. Зрительно «вытянуть» прическу поможет скандинавский поинт или шатуш. Последняя техника подразумевает покраску с сохранением натурального цвета на макушке (как правило, выбирается более светлая палитра).
Создание «эффекта укладки». Чтобы волосы выглядели более ухоженными, стоит выбрать технику с сочетанием несколько оттенков одного цвета. В данном случае хорошим решением станет колорирование.

Таким образом, выбор правильного варианта поможет сформировать продуманный образ, привлекающий взгляды!

Основные правила выбора техники

При выборе способа окрашивания стоит учитывать цвет глаз и кожи. Так, все техники блондирования не подходят кареглазым девушкам со светлой кожей. В таком случае оптимальным решением станет эффект омбре, балаяж или шатуш, в которых используются карамельные, шоколадные оттенки.

Обладательницам голубых глаз стоит использовать еще одну модную в этом сезоне технику – мелирование с созданием пепельного оттенка. Такое решение особенно смотрится особенно эффектно на коротких или волнистых шевелюрах. Отличным вариантом в этом случае станет любой из способов блондирования – от скандинавского поинта до хаотичного распределения более светлых и более темных прядей.

Современные техники окрашивания

ЧЕТЫРЕ самые актуальные салонные техники окрашивания без использования начеса и контуринг у лица — на курсе СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ факультета КОЛОРИСТИКИ школы DEMETRIUS:

ОМБРЕ
ШАТУШ
БАЛАЯЖ
ОБЪЕМНОЕ ОКРАШИВАНИЕ

Это «стандартный набор» необходимых навыков мастера в области окрашивания волос, который должен в совершенстве освоить успешный мастер!

Если вы:

не уверены в своем профессиональном мастерстве
хотите следовать модным тенденциям и предлагать клиентам тренды
чувствуете, что вам не хватает знаний
волнуетесь за конечный результат окрашивания и устали искать причины ошибок

На курсе обучения парикмахеров

СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИКИ ОКРАШИВАНИЯ вы научитесь:

растяжке цвета, уже ставшей классикой и дающей плавный градиент от темных корней к максимально светлым концам
растяжке цвета, позволяющей добиться эффекта выгоревших прядей на окрашенных или натуральных волосах, и идеально подходящей для коррекции отросшей растяжки или блонда
создавать эффект цветового контраста между кончиками и основными прядями или же между корнями и остальными волосами
добиваться максимального рассветления с рельефным рисунком, максимально близко к корню
разбивать мелирование, добавлять прядей блондинкам и создавать красивый рисунок с нечитаемыми прядями разной толщины
комбинировать все нюансы

После обучения вы:

станете экспертом в области современных модных окрашиваний
сможете гарантированно получать запланированный результат и выполнять работу на высшем классе
исключите ошибки в процессе окрашивания

получите модных и изысканных клиентов
легко поднимите цене на свои услуги

Продолжительность курса: 2 дня.
Для мастеров с опытом от 1,5 года

Становитесь топовыми мастерами вместе с DEMETRIUS и получайте преданных клиентов!

Обучение самым модным и актуальным женским стрижкам – вы найдете на курсах обучения парикмахеров факультета ЖЕНСКИХ СТРИЖЕК школы DEMETRIUS.

20 стильных сомбре — самой модной техники окрашивания сезона

Вы наверняка знакомы с техниками окрашивания омбре и балаяж, но с техникой сомбре многие сталкиваются впервые. Сомбре – это когда более темный цвет волос сверху очень плавно и нежно переходит в чуть более светлый оттенок на концах. Окрашивание похоже на омбре, но без резкого и контрастного перехода.

www.pinterest.com

Эффект сомбре похож на естественное окрашивание, будто волосы выгорели на солнце и цвет остался лишь на концах. Но в отличии от такого естественного состояния волос, сомбре выглядит красиво и ухоженно.

www.pinterest.com

Темно-коричневый, почти черный цвет хорошо сочетается с прохладным пепельно-грибным. Сомбре в этом случае подходит лучше всего – переход получается мягким и незаметным.

www.pinterest.com

Сомбре можно сочетать с легким и тонким мелированием, чтобы пряди были еле заметного оттенка. Волосы получатся выразительными и многослойными по цвету

www.pinterest.com

Частичное светлое окрашивание, совмещенное с сомбре сделает ваши темные волосы светлее, но без резкой контрастности.

www.pinterest.com

На русых волосах сомбре тоже выглядит эффектно. Растяжка с контурным окрашиванием сделает вас свежее и мягче, волосы будут выглядеть словно после отпуска на жарком морском побережье.

www.pinterest.com

Как вам такой вариант окрашивания? Здесь практически не видно темных волос, но создается ощущение многослойного цвета. Волосы выглядят густыми, объемными, выразительными.

www.pinterest.com

Трехцветное сомбре может выглядит невероятно красиво и актуально. Такое окрашивание имеет массу плюсов: вам не нужно подкрашивать корни и делать частую коррекцию.

www.pinterest.com

Совместите сомбре и контурное окрашивание у лица. Это позволит сделать ваш цвет волос мягче, а образ – модным. Кстати, с темно-коричневым отлично сочетается карамельно-медовый, чуть теплый оттенок.

www.pinterest.com

Поразительно красивый и очень “зимний” цвет, который лучше всего выглядит именно в такой технике окрашивания. Темный холодный цвет мягко переходит в пепельно-седой – такое сочетание хорошо подходит холодному цветотипу.

www.pinterest.com

Сомбре по-разному выглядит на прямых и волнистых волосах. В первом случае цвет будет смотреться более естественно, а во втором – как сложное окрашивание в натуральном стиле. А если добавить несколько тонких светлых прядей, то цвет получится еще более объемным.

www.pinterest.com

Прекрасное песочно-бежевое сомбре с легким пепельным подтоном. Цвет выглядит нейтральным – не слишком теплым и не слишком холодным, поэтому подойдет многим.

www.pinterest.com

Сомбре можно совместить с балаяжем или частым мелированием. Только в последнем случае пряди должны быть тонкими, пусть они начинаются не от самых корней, а с отступом в 1-2 см.

www.pinterest.com

Еще один вариант пепельно-черного сомбре. Смотрится стильно и не требует особого ухода, лишь поддержки цвета специальными масками для волос.

www.pinterest.com

Переход от более темного к светлому может быть длинным или коротким. То есть, светлый оттенок начинается либо с отступом в 10-15 см от корней, либо от середины длины волос.

www.pinterest.com

На прямых и очень длинных волосах легкий эффект сомбре выглядит красиво и натурально. Вы легко отрастите свой цвет волос с такой техникой, не прибегая к частым окрашиваниям.

www.pinterest.com

Посмотрите как идеально выглядит этот цвет! Из брюнетки вы легко можете стать блондинкой без особого вреда для волос с техникой окрашивания сомбре.

www.pinterest.com

Этот кофейно-коричневый покорил наши сердца. Мягкая растяжка делает окрашивание натуральным и естественным, позволяя вам наслаждаться новым оттенком дольше.

www.pinterest.com

А вы пробовали такую технику окрашивания? Ждем ваших отзывов!

Читайте нас в Яндекс Дзен LADYLINE.ME и Сам Себе Парикмахер

Основные современные техники окрашивания/мелирования — презентация онлайн

ОСНОВНЫЕ СОВРЕМЕННЫЕ
ТЕХНИКИ
ОКРАШИВАНИЯ/МЕЛИРОВАНИЯ
МЕЛИРОВАТЬ (mêler). Cмешивать. Осветлять волосы или отдельные пряди.
Мелирование — способ окрашивания волос, а точнее, осветление отдельными
прядями.
При этом окрашиванию подвергаются не все волосы, а только часть. Волосы
выбираются разными прядями или штопкой, и при нанесении состава
изолируются фольгой или термобумагой для окрашивания, каждая прядь

отдельно. Раскладки, т.е. порядок проборов прядей, разнообразны и зависят от
фантазии мастера или от желаемого эффекта. При мелировании используются
блондирующие препараты, которые могут иметь разные оттенки, а также могут
использоваться краски светлых тонов или в паре, создавая контраст с
неокрашенными волосами.
Растяжка цвета – это горизонтальный или вертикальный переход цвета от
темного к светлому. Переход может быть контрастным (жестким) и более
мягким.
SHATUSH — Шатуш
Название технологии происходит от английского слова «shatoosh», означающего дорогой и очень редкий вид
шерсти. Шатуш не дает создать четкие линии, световые пятна.
Существует два способа выполнения техники шатуш:
КЛАССИЧЕСКИЙ и ОБЛЕГЧЕННЫЙ
Классический — для растяжки
цвета на короткой и средней длины
волос.
SHATUSH — Шатуш
Облегченный — для длинных волос – очень мягкая растяжка
цвета.
SunLights (СанЛайтс)
Растяжка цвета на коротких волосах.

Выполняется после фиксации волос лаком
BALAYAGE (Балаяж)
Балаяж (выметать) – полностью характеризует
принцип нанесения красителя. Т.е. мы наносим
краситель размашистыми движениями создавая
растяжку с вертикальными полосами. Данные полосы
могут быть, как ярко выраженными, так и более
скрытыми.
Flame Balayage (Флам Балаяж)
Флам Балаяж (языки пламени) – может быть, как
контрастным, так и мягким. Никогда не применяйте
данный метод растяжки цвета на массивной форме
стрижки. Лучше всего смотрится на теплых оттенках
волос.
OMBRE (Омбре)
Омбре – слово пришло из французского языка и в сфере дизайна
означает градацию цвета. Французский синоним растяжки цвета. В
отличии от Балаяж – выполняется более скрупулезно. Движение кисти
идет так же, как и в технике Балаяж вертикальными линиями, но
более мелкими и без формирования вертикальных полос. В
классическом виде Омбре имеет более контрастный переход оттенков
в точке перехода цвета. Без плавности и мягкости переходов.
SOMBRE (Сомбре)
Сомбре – не имеет ярко выраженной точки перехода, т.е.
растяжка цвета очень мягкая в точке перехода цвета.
OVERFLOW (Оверфлоу)
Overflow (перетекание) – самый щадящий метод колорирования, но для получения
необходимого эффекта необходимо больше времени, чем при других видах окрашивания.
Однако, это компенсируется великолепным видом – такого плавного перехода цвета
невозможно добиться ни при одном типе окрашивания. Как правило, такой метод предлагается
клиентам для создания растяжки на неокрашенных волосах и коррекции ранее выполненной
растяжки.
DIP-DYE (Дип – Дай)
Dip-dye – технология, являющаяся трендом среди стилистов и знаменитостей. В отличие от
омбре, она подразумевает окрашивание волос в другой цвет, как правило, яркий и
несколько неожиданный.
DIM-OUT (Дим-Аут)
Dim-Out — так называемая обратная растяжка цвета. Используется для перехода от базового

окрашивания на растяжку. Является идеальным вариантом для блондинок, которые не хотят
регулярно осветлять корни. Плавное затемнение корней в цвет, близкий к натуральному, будет
смотреться естественно, и уже не будет необходимости в их подкрашивании.
Калифорнийское мелирование
Калифорнийское мелирование выполняется на волосах с УГТ выше 6. В отличии от
предыдущих методов Калифорнийское мелирование очень похоже на классическое
мелирование, т.е. выполняется крупными прядями, расположенными в шахматном порядке.
Но, при этом, точка перехода цвета находится практически у корней волос.
Венецианское мелирование
Венецианское мелирование выполняется одинаково, как Калифорнийское мелирование,
но отличаются светлотой. Венецианское мелирование выполняется на волосах с УГТ ниже 6.
Точка перехода цвета также находится практически у корней волос.
Melange Highlights (Меланж Хайлайтс)
Меланжевое мелирование – идентично классическому
мелированию на фольгу, только более мягкий и
спокойный без ярко выраженных прядей. Выполняется
при помощи эффект-лопатки (планшет-лопатка).
Degrade (Деграде)
Деграде – данный способ растяжки цвета формирует четкие и
чаще всего контрастные переходы градации цвета. Часто
применяется для создания переходов между контрастными
цветами в выделенных блоках.
Baby Lights (Бэби Лайтс)
Бэби Лайтс — техника растяжки, позволяющая создавать на волосах изумительный
эффект солнечных бликов. Он особенно выигрышно смотрится на тонких волосах, в
хвосте. Свое название берет от вида выгоревших на солнце у детей волос.
Марморирование
Марморирование (Глассаж) – отличительной
чертой данного способа нанесения является тот
факт, что обесцвечивающий состав наносится
поверх красителя.
Airtouch (Айртач)
Airtouch представляет собой сложное многоцветное
окрашивание с мягкими переливами нескольких
родственных оттенков. Большим преимуществом данной
техники является плавный рассеянный переход
осветленных и неосветленных прядей. За счет этого
граница натуральных отросших корней растушевана так
мягко, что даже спустя несколько месяцев окрашивание
выглядит очень красиво и естественно. Окрашивание волос
техникой Airtouch – технологически сложный и
кропотливый процесс. Работа с длинными и густыми
волосами может занять от 4х до 6 часов.
Airtouch (Айртач)
Пример выполнения техники
Airtouch на светлых волосах.
Airtouch (Айртач)
Пример выполнения техники Airtouch на темных волосах.
Airtouch (Айртач)
Пример выполнения техники Airtouch на рыжих волосах.
Какие техники окрашивания применялись на данных моделях?
Contouring (Контуринг)
Contouring основана на принципе чередования светлых и темных прядей. Эта методика
используется для того, чтобы обрисовать выигрышные черты лица и смягчить угловатость.
Также с помощью контуринга можно сделать стрижку центром внимания и придать образу
яркость и запоминаемость. Такая новомодная тенденция, как контуринг волос, способна
визуально подправить дефекты лица и скрыть недостатки. Принцип его действия основан (как
и в контуринге с помощью макияжа) на сочетании темных и светлых оттенков. Светлые
акцентируют внимание на выигрышных областях, тогда как темные скрывают недостатки.
Контурирование — это не просто чередование оттенков одного цвета, это техника, которая
требует соблюдения правил. Только в этом случае результат будет соответствовать
ожиданиям. Темная краска выполняет роль тени и скрывает длинные или широкие части
лица, светлая же выступает, как отражатель, поэтому они принимают на себя большее
внимание и удлиняют форму.
Прежде, чем приступать к выполнению этой техники окрашивания, нужно узнать форму лица.
Также немаловажным фактором является цветотип внешности, ведь только отталкиваясь от
него можно подобрать удачный цвет.
длинные лица
короткие лица
треугольник
ромб
прямоугольник
круг
квадрат
сердце
А1: верхняя зона
темный
светлый
темный
светлый
светлый
темный
А2: центральная
зона
светлый
темный
светлый
темный
светлый
темный
А3: нижняя зона
темный
светлый
светлый
темный
темный
светлый
1.
4.
1.
2.
3.
4.
5.
2.
3.
5.
Коррекция круглой формы.
Коррекция овальной
формы.
Коррекция ромбовидной
формы.
Коррекция прямоугольной
формы.
Коррекция треугольной
формы.
СХЕМЫ
При классической работе условно выделяют три схемы разделения головы для
выполнения растяжек цвета:
1. Луковица
2. Подкова
3. Диагонали
Луковица
Хорошо подходит при работе с методами Меланжевое мелирование и Dim-Out. Во всех
остальных случаях лучше всего избегать данной схемы разделения, поскольку любая ошибка
нанесения будет видна в конечном результате.
Подкова
Хорошо применима при использовании методов нанесения – Калифорнийское
мелирование, Highlights (Хайлайтс), Degrade (Деграде), Shatush (Шатуш).
Диагонали
Отлично подходит для работы с методами растяжек цвета Shatush (Шатуш), Ombre
(Омбре), Sombre (Сомбре), Balayage (Балаяж) и Flam Balayage (Флам Балаяж).
Огромным отличительным плюсом схемы является тот факт, что ошибки в
нанесении зрительно скрываются в результате диагонального расположения
прядей.
Создание техник окрашивания
Лекала:
Волна (Три зоны)
Кольцо
Краевая
Круг
Квадрат
Треугольник
Ромб
Многоугольник
Зигзаг
На пробор
Челка
Центрическое
Золотое сечение
Параллели
Фронтальная
Хаотичная
КОНЕЦ ТЕОРИТИЧЕСКОЙ ЧАСТИ.
ПРИСТУПАЕМ К ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЕ!

Техники окрашивания волос: отличаем шатуш от омбре!

Стилисты во всеоружии! День за днем они создают шедевры окрашивания, а мы любуемся. Тоже хотите сменить образ, но не знаете, как говорить с модным миром на его языке? Мы расскажем, что значат популярные сегодня бьюти-термины, чтобы вы разбирались в техниках окрашивания не хуже мастеров индустрии красоты!

Омбре – техника окрашивания волос, которая помогает добиться плавного перехода между двумя оттенками с разницей более двух тонов. Вариантов выполнения большое количество, однако наибольшей популярностью пользуется втушевывание осветляющего продукта (порошка или пасты) в краситель.

В результате получаем на волосах переход от более темного оттенка у корней к блонду на концах.

L’Oreal

Шатуш – техника окрашивания волос, которая помогает получить плавный переход цвета и устранить ошибки предыдущих окрашиваний. Выполняется через начес. Разница между оттенками красителей – не менее двух тонов.

В результате основной цвет мы видим на корнях, середина (где выполнен начес) – на два тона светлее, и на концах получаем блонд.

Wella

Балаяж – техника осветления волос путем осветления выделенных локонов. Выполняется рисованием осветляющим продуктом на каждой пряди.

Ширина пряди определяется индивидуально. Чем тоньше, тем более светлый эффект получится. У основания осветляющая смесь не должна пропитывать волосы, а остаться только на поверхности. К концам мазки шире и осветляющий продукт пропитывает волосы сильнее.

В итоге получаем мягкие и естественные блики у основания, которые переходят в более светлые нюансы на концах.

Schwarzkopf

Брондирование – техника окрашивания волос, которая позволяет сочетать теплые, нейтральные и даже холодные оттенки.

В этой технике можно сочетать более трех оттенков цвета. Красители выбирают более щадящие. Разница между оттенками не должна быть более 3‑4 тонов. В результате получаем многогранное окрашивание, которое создает больше объема и движения в волосах.

Schwarzkopf

Колорирование – это техника окрашивания, которая подразумевает создание большого количества оттенков и цветов на волосах. Возможно сочетание как оттенков одного цветового направления, так и совершенно различных. Можно выполнять в технике мелирования или вертикально окрашивать отдельными сегментами.

В результате получаем хитросплетение различных нюансов и оттенков, многогранность цветовых направлений.

Inebrya

Пиксельное окрашивание – это вид окрашивания волос слоями с использованием ярких контрастных цветов.

Выполняется на отдельных зонах или по всей голове. Подходит для прямых по структуре волос.

В итоге мы видим сложный рисунок из нескольких оттенков одного цвета.

Elgon

Деграде – техника окрашивания волос, которая помогает сохранить более контрастный переход между двумя оттенками цвета. Вариантов выполнения много. Можно окрашивать отдельные локоны или все волосы, добавлять промежуточные оттенки.

В итоге мы получаем более темный оттенок у корней для придания глубины цвету и более светлые концы, что всегда освежает образ.

Wella

Текст: Муратова Каринэ
Оформление: Бражникова Анна

Окрашивание волос: самые модные техники окрашивания, на которые стоит обратить внимание

Весна – время перемен, в том числе и во внешности. Один из самых популярных способов обновить свой образ – покрасить волосы. Окрашивание волос 2020 года предполагает в первую очередь щадящие методы и заботу о здоровье. Мы собрали для вас различные виды окрашивания волос, чтобы каждая смогла найти что-то для себя.

Существует множество разных техник окрашивания волос, которые стилисты используют в зависимости от ожидаемого результата и состояния волос клиента. Часто их сложно отличить друг от друга: балаяж и омбре, например, выглядят очень похоже. Но настоящий специалист точно знает, где какая техника использовалась. Устроим небольшой экскурс и разберемся, какие бывают техники окрашивания волос в 2020 году.

Колорирование волос – это профессиональная техника окрашивания, при которой используется несколько оттенков краски, обычно близких друг к другу. Мастер делит волосы на зоны, а зоны – на отдельные пряди, каждая из которых окрашивается определенным цветом. Цвета отличаются на пару тонов, что гарантирует красивый переход. Колорирование может быть полным или частичным. В первом случае красящий состав наносится на все волосы, а во втором – на выборочные пряди.

Во время мелирования окрашиваются лишь отдельные пряди. Главное отличие мелирования от колорирования – использование только одного оттенка. Чаще всего речь идет об осветлении, но иногда это могут быть какие-то необычные и яркие цвета. Главная отличительная черта мелирования – краска наносится не на все волосы, а лишь на их часть. За счет этого получается интересный контраст с родным цветом волос. Мелирование и колорирование часто путают: разница заключается в количестве оттенков.

Чтобы разделить пряди, мастер в салоне обычно использует специальную шапочку или фольгу, на которую выкладываются пряди.

Омбре – это техника двухцветного тонирования волос. Мастером используется особый метод окрашивания, в результате которого получается красивый переход из одного цвета к другому. Краска неравномерно наносится на всю длину волос. В итоге у корней, как правило, получается темный оттенок, а на кончиках ― блонд.

Сомбре

Название «сомбре» произошло от английских слов soft, subtle + ombre, что означает мягкое омбре. Такая техника подойдет для ослабленных и поврежденных волос, ведь она предполагает окрашивание щадящим методом, структура волос в таком случае не затрагивается. Более светлым оттенком на волосах создаются легкие блики, которые дают эффект выгоревших волос. Этот вид окрашивания подходит как для светлых, так и для темных волос, при этом не затрагивает корни волос.

Брондирование

Брондирование – это особый вид колорирования волос, когда все используемые оттенки находятся рядом в цветовой палитре. Результат – эффект выгоревших волос и плавный переход в коричневых тонах. Такой вид окрашивания идеально подойдет девушкам, которые хотят лишь слегка обновить свой образ, а не менять его на 180 градусов. Особенно красиво брондирование смотрится на длинных и средних волосах.

Мажимеш

Мажимеш ― это техника окрашивания, которая идеально подходит для легкого осветления светлых волос. Термин произошел от названия краски L’Oréal Professionnel Majimeches. Благодаря этой технике обладательницы русых волос и блонда могут получить оттенок на 5–7 тонов светлее изначального. В составе содержатся компоненты, которые укрепляют структуру волоса, поэтому такой метод окрашивания подходит даже девушкам с сухими и ломкими волосами.

Тонирование

Тонирование волос – самый щадящий метод окрашивания. Во время тонирования мастер использует красящий состав, в котором практически не содержится аммиака. Благодаря этому волосы сохраняют свой натуральный пигмент и лишь немного меняют оттенок. Эту процедуру легко выполнить и в домашних условиях: надо лишь знать, какой состав использовать. Правда, такое окрашивание гораздо менее стойкое, чем обычное, а то, сколько оно продержится, зависит от частоты мытья головы. Если вы хотите закрасить седину, тонирование вам не подойдет. И помните: этот вид окрашивания предполагает изменение цвета на пару тонов, не больше.

Однотонное окрашивание

Еще одна простая техника – однотонное окрашивание. Процедура проходит с использованием более мощных составов, чем при тонировании, поэтому цвет получится ярким и стойким. Его тоже можно выполнять в домашних условиях, но уже с большими рисками: неудачный оттенок будет держаться долго. По этой причине лучше поступить так: мастер в салоне подбирает идеальную краску под ваши нужды, а вы обновляете цвет самостоятельно, уже зная, какой именно состав вам понадобится.

Шатуш

Абсолютный фаворит для всех, кто любит естественность, – это шатуш. Техника напоминает омбре: не затрагивает корни, имитирует эффект выгоревших волос. При этом в шатуше больше хаотичности: переход получается за счет окраски прядей. От мелирования техника шатуш отличается технологией растягивания цвета. По этой причине такое окрашивание лучше всего смотрится на длинных волосах: на коротких сложнее продемонстрировать переход.

Аиртач

Название «аиртач» произошло от английского словосочетания air touch, что означает «прикосновение воздуха». Действительно, оно выглядит воздушным, почти незаметным, но при этом может изменить и освежить ваш внешний вид. Техника аиртач поможет блондинкам добавить пару светлых прядей, а брюнеткам – посмотреть на себя со светлыми волосами и не бояться, что они безнадежно испортятся.

Балаяж

Балаяж – еще одна техника градуированного окрашивания. Оно не затрагивает корни волос: окрашиваются только середина и кончики. Мастер отступает десять–пятнадцать сантиметров от корней и начинает процедуру осветления отдельных прядей. Результат – легкие перемены в цвете, которые особенно хорошо будут выглядеть на слегка завитых волосах.

Элюминирование

Элюминирование совмещает в себе лечение волос и окрашивание, так что вас ожидает и идеальный цвет, и безупречный блеск. Окрашивание происходит следующим образом: сначала глубокое очищение, затем непосредственно окрашивание, а в конце – специальный состав, который фиксирует цвет и защищает от вредного воздействия окружающей среды.

Деграде

Еще один вариант градиентного окрашивания – это деграде. Цветовая гамма может быть любой, главное, чтобы цвет у корней был один, а на кончиках – совсем другой. При этом по длине предполагается плавная растяжка цвета.

Окрашивание 3D

Однотонное окрашивание волос часто выглядит неестественно, особенно если его выполнял непрофессионал. По этой причине популярность набирает 3D-окрашивание. Такая техника визуально добавит вашим волосам объем, а цвету – глубины. Окрашивание происходит следующим образом: один оттенок берется за базовый, два-три других – за дополнительные. В эти цвета окрашиваются небольшие пряди, за счет чего достигается максимально плавный переход цвета. Один из главных плюсов такого вида окрашивания – это то, что его долгое время не надо корректировать. Волосы у корней будут выглядеть аккуратно даже спустя несколько месяцев: будто так и задумывался переход.

Окрашивание волос мелками

Окрашивание волос специальными мелками – отличная идея для тех, кому хочется добавить чего-то бунтарского в свой образ, но кардинально менять его не хочется. Такие мелки продаются в магазинах профессиональной косметики для волос, и ими довольно легко пользоваться: нужно нанести их на пряди, которые вы хотите покрасить. Цвет вернется к родному сразу после мытья головы. Не забудьте воспользоваться увлажняющей маской после этого: мелки хоть и не относятся к стойким красящим средствам, но сушат и ослабляют волосы.

Неоновое окрашивание

А вот вариант с неоновым окрашиванием подойдет тем, кому надоели постоянные перекрашивания из блондинки в брюнетку и наоборот. Если вам хочется чего-то принципиально нового, почему бы не сделать свои волосы ярко-розовыми или неоново-зелеными? С такими пожеланиями лучше идти к профессиональному мастеру, а не экспериментировать самостоятельно, в домашних условиях. Яркие краски требуют серьезного опыта для работы с ними. Более того, чтобы добиться такого оттенка, волосы нужно предварительно осветлить.

Двухцветное окрашивание

Еще одна идея для смелых: двухцветное окрашивание. Возьмите два контрастных цвета и покрасьте одну половину волос в один цвет, а другую – в другой. Самое главное – четкая граница между цветами. В таком случае будет понятно, что это творческая задумка автора, а не случайность.

Трафаретное окрашивание

Еще один вид окрашивания, который не позволит вам слиться с толпой. Это настоящее произведение искусства, когда в качестве холста используются волосы. Особенно интересно трафаретное окрашивание смотрится на коротких волосах: на такой длине легче всего прокрасить весь верхний слой волос. Волнистые или кудрявые волосы – верный признак, что лучше выбрать другое окрашивание. Скорее всего, рисунок получится нечетким и задумку будет сложно уловить.

Мастер наносит рисунок по трафарету – заготовке, которая подбирается в индивидуальном порядке для каждого клиента. Роль играют личные предпочтения, структура и цвет волос, длина и ожидаемый эффект.
Будьте внимательны: как только вы решите сменить пробор или слегка по-другому уложить волосы, рисунок уже не будет выглядеть идеально. Поэтому, если вы боитесь, что одна и та же прическа вам надоест, предупредите об этом мастера. Тогда вы выберете узор, который допускает внесение небольших изменений.

Хиты сезона 2020

Главными хитами сезона 2020 в окрашивании стали два противоположных тренда: естественность и яркость. С одной стороны, балаяж, мелирование, аиртач и другие техники, которые не меняют цвет кардинально, а лишь добавляют бликов, а с другой – неоновые цвета и трафаретное окрашивание.

Если вы выбираете натуральность, то присмотритесь к техникам, где краска наносится на определенном расстоянии от корней волос. Это гарантирует, что любое окрашивание, которое вы сделаете, будет вам к лицу. По тому же принципу вы можете попробовать покрасить кончики волос кислотным цветом, а на остальной длине оставить родной цвет. Так вы сможете присмотреться и понять, готовы ли вы к более радикальным переменам.

Модное окрашивание волос – фото

Мелирование волос, шатуш и амбре окрашивание. Нижний Новгород — SPA Лорэн

Самые новые и современные, сложные техники окрашивания предлагают стилисты салона красоты «SPA Лорэн». Эти техники позволят создавать индивидуальные и неповторимые образы даже для самых взыскательных клиенток. Работа в данных техниках трудозатратна, но очень практична в носке и требует корректировки не раньше чем через 12 недель.

Грамотное окрашивание — это настоящее искусство. За красивым цветом волос надо ходить в салоны красоты. Краситься самостоятельно опасно и создать что-то красивое вряд ли получится. Доверьтесь специалисту , именно мастер стилист определит, какая из множества существующих техник окрашивания подойдет именно вам.

Такие способы окрашивания волос подходят практически любой барышне. Преимущество в том, что можно варьировать яркость, свет, оттенки, расставлять акценты и делать массу волос интересной и многогранной.

Брондирование

Эффект абсолютного растекания темного цвета в светлый, любой степени контрастности. Термин «брондирование» был создан при сочетании английских слов «brown», в переводе коричневый, и «blond», что означает светлый. Можно сказать, технология брондирования включает сочетание светлого и коричневого.

Эта последняя мода решила давний спор между брюнетками и блондинками. Сейчас самой модной девушкой является «брондинка». При этом бронд, это не один, и даже не два, а минимум три, красиво сочетающихся между собой разных цвета.

При брондировании тёмных волос используется окрашивание волос при помощи техники клорирования. С этой техникой достигается эффект мягкого перелива золотистых и коричневых цветов. Оттенки играют, плавно переливаются друг в друга. Цвета-кофейный, шоколадный, русый, переходят в золотистый блонд. Результат окрашивания приближен к своему естественному оттенку.

Babylight

Это — абсолютно новая техника окрашивания волос(микроколорирование), в рамках которой осветляются очень тонкие пряди. Таким образом, создается эффект «детских выгоревших волос». Вспомните себя в детстве: большую часть времени Вы проводили на улице, под солнечными лучами. И солнышко создавало природные блики на волосах. Теперь такой эффект можно получить в салоне красоты.

Flamboyage

Фламбояж (flamboyage) — от французского слова flamboyant — «полыхать», «пламенеть», с эффектом постепенных, очень естественных переходов одного цвета в другой, с эффектом мягких и очень естественных бликов. Фламбояж позволяет подчеркнуть форму стрижки и натуральный цвет волос, он сделает его более ярким и интересным, а также усилит оттенок окрашенных волос.

Окрашивание фламбояж имеет массу преимуществ. Оно не вредит волосам, придает натуральному или приобретенному цвету глубину. В результате пропадает необходимость часто обновлять цвет у парикмахера, ведь при фламбояже в случайном порядке окрашиваются тончайшие пряди, которые смешиваются с общей массой волос, а когда волосы начинают отрастать, разница между длиной волос и отросшими корнями практически незаметна даже спустя два-три-четыре месяца после процедуры.

Чаще всего техника фламбояж используется в создании простых, стильных повседневных образов.

Шатуш

Это мелирование, точнее его разновидность, но с эффектом растяжения цвета. Выполняется оно, в отличие от мелирования, без фольги и шапочки, то есть на открытом воздухе. Для нужного результата окрашиваются лишь небольшие, но частые, хаотично выбранные прядки, но не по всей длине, а с некоторым отступом от корней. Его границы образуются за счет начесывания прядей.

ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕХНИКИ ШАТУШ Нет контрастных линий, что выглядит естественно, напоминая летнее выгорание волос на солнце. Техника создает плавные переходы от темного к светлому, создавая некую игру цвета, что при любом виде освещения будет замечательно смотреться и создавать более глубокие и насыщенные оттенки. Окрашивание шатуш визуально придает объем вашим волосам. Шатуш — отличный способ спрятать отрастающие корни, и позволить волосам естественно отрастать (при желании), не испортив привлекательности. Делать корректировку шатуша, чтобы не сбивались линии растушевки, необходимо не чаще 1 раза в 2,5–3 месяца, что достаточно редко, в отличие от мелирования или обычного окрашивания. С помощью шатуш можно спрятать седину, но если она занимает не более третьей части всех волос.

Омбре

Суть техники омбре, кроется в ее названии, которое в переводе с французского означает «тень» или «затемнение». Мастер-колорист вытягивает цвет по всей длине волос, создавая эффект тени: корни и прикорневая часть остаются нетронутыми (иногда немного затемняются), а кончики красятся в более светлый оттенок. В результате получается стильный градиент, который может иметь как размытую границу перехода, так и максимально четкую.

Марморирование

Марморирование (мраморное) это специальная техника, которая сегодня стремиться к натуральности, а так же благородности различных оттенков — в наше время это самая модная тенденция окрашивания человеческих волос. Ей соответствует осветление отдельных прядей, что в свою очередь помогает расставить акценты в прическе. Данный способ осветления дает возможность придать волосам многогранный, роскошный вид.

Это техника, которая работает во всех цветовых направлениях и подходит любому клиенту и типу волос, через создание мягкого и очень естественного, почти мраморного перелива.

Работа в техниках сложного окрашивания трудозатратна и занимает не менее 3 часов, но очень практична в носке, требует корректировки, не раньше чем 12 недель.

Будьте уверены, про все возможности, плюсы и минусы вам расскажут профессионалы. Какую технику окрашивания выбрать именно вам — посоветуют парикмахеры-стилисты салона «SPA Лорэн».

Методы окрашивания

Поскольку микробная цитоплазма обычно прозрачна, необходимо окрашивать микроорганизмы, прежде чем они будут видны в световой микроскоп. В некоторых случаях окрашивание не требуется, например, когда микроорганизмы очень большие или когда необходимо изучить подвижность, и каплю микроорганизмов можно поместить непосредственно на предметное стекло и наблюдать. Такая подготовка называется мокрым креплением . Влажный образец можно также приготовить, поместив каплю культуры на покровное стекло (стеклянную крышку для предметного стекла), а затем перевернув ее над полым предметным стеклом.Эта процедура называется «висящей каплей ».

При подготовке к окрашиванию небольшой образец микроорганизмов помещается на предметное стекло и сушится на воздухе. Мазок фиксируется нагреванием, быстро проводя его над пламенем. Тепловая фиксация убивает микроорганизмы, заставляет их прилипать к предметному стеклу и позволяет им принять пятно.

Простые методы окрашивания. Окрашивание можно проводить основными красителями, такими как кристаллический фиолетовый или метиленовый синий, положительно заряженные красители, которые притягиваются к отрицательно заряженным материалам микробной цитоплазмы.Такой процедурой является простая процедура окрашивания . Альтернативой является использование красителя, такого как нигрозин или конго красный, кислых, отрицательно заряженных красителей. Они отталкиваются отрицательно заряженной цитоплазмой и собираются вокруг клеток, оставляя клетки прозрачными и неокрашенными. Этот метод называется методом отрицательного окрашивания .

Дифференциальные методы окрашивания. Методика дифференциального окрашивания различает два вида организмов. Примером может служить метод окраски по Граму . Этот дифференциальный метод разделяет бактерии на две группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии. Сначала наносится кристаллический фиолетовый, а затем протравный йод, фиксирующий пятно (рисунок). Затем предметное стекло промывают спиртом, и грамположительные бактерии сохраняют кристально-фиолетовое пятно йода; однако грамотрицательные бактерии теряют окраску. Впоследствии грамотрицательные бактерии окрашиваются сафраниновым красителем, контрастирующим красителем, используемым следующим. Эти бактерии выглядят красными под масляно-иммерсионными линзами, а грамположительные бактерии выглядят синими или пурпурными, что отражает кристаллический фиолетовый цвет, оставшийся на этапе промывки.

Другой метод дифференциального окрашивания — это кислотостойкий метод . Этот метод отличает виды Mycobacterium от других бактерий. Для переноса первого красителя, карболфуксина, в клетки используется тепло или липидный растворитель. Затем клетки промывают разбавленным кислотно-спиртовым раствором. Виды Mycobacterium сопротивляются действию кислоты и спирта и сохраняют окраску карболфуксина (ярко-красный). Другие бактерии теряют пятно и приобретают последующее окрашивание метиленовым синим (синим).Таким образом, кислотоустойчивые бактерии выглядят ярко-красными, в то время как некислотные бактерии выглядят синими при наблюдении под иммерсионной микроскопией в масле.

Другие методы окрашивания направлены на выявление различных важных бактериальных структур. Например, специальная техника окрашивания выделяет жгутики бактерий, покрывая жгутики красителями или металлами для увеличения их ширины. Затем можно наблюдать окрашенные таким образом жгутики.

Для исследования спор бактерий используется специальный метод окрашивания. Малахитовый зеленый используется с теплом, чтобы заставить пятно проникнуть в клетки и придать им цвет. Затем используется контрастное краситель, сафранин, чтобы придать цвет неспорообразующим бактериям. В конце процедуры споры окрашиваются в зеленый цвет, а другие клетки окрашиваются в красный цвет.

Процедура окрашивания по Граму для разделения бактерий на две группы .

Другой метод дифференциального окрашивания — это кислотостойкий метод . Этот метод отличает виды Mycobacterium от других бактерий.Для переноса первого красителя, карболфуксина, в клетки используется тепло или липидный растворитель. Затем клетки промывают разбавленным кислотно-спиртовым раствором. Виды Mycobacterium противостоят действию спиртовой кислоты и сохраняют окраску карболфуксина (ярко-красный). Другие бактерии теряют пятно и приобретают последующее окрашивание метиленовым синим (синим). Таким образом, кислотоустойчивые бактерии выглядят ярко-красными, в то время как некислотные бактерии выглядят синими при наблюдении под иммерсионной микроскопией в масле.

Другие методы окрашивания направлены на выявление различных важных бактериальных структур.Например, специальная техника окрашивания выделяет жгутики бактерий, покрывая жгутики красителями или металлами для увеличения их ширины. Затем можно наблюдать окрашенные таким образом жгутики.

3.4: Краткое описание распространенных методов бактериального окрашивания

Простое окрашивание

Кристально-фиолетовый, метиленовый синий, сафранин

Используется для придания цвета прозрачным в противном случае бактериальным клеткам
Может использоваться для определения размера, морфологии и расположения клеток

Пятно по грамму

Первичная морилка — кристально-фиолетовый

Протравы — йод; обесцвечивающее средство — 95% этанол

Контркрашивание — Safranin

Обычное дифференциальное пятно
Реакция по Граму (положительная или отрицательная) отражает свойства клеточной стенки
Также используется для определения размера, морфологии и расположения клеток

Кислотостойкое окрашивание

Первичная окраска — Карбол фуксин

Обесцвечивающее средство — кислотный спирт

Контрастер — метиленовый синий

Дифференциальная окраска, используемая для обнаружения бактерий с клеточными стенками миколиновой кислоты (род Mycobacterium и Nocardia )
Разработано для обнаружения видов бактерий, вызывающих туберкулез
Кислотостойкие организмы устойчивы к обесцвечиванию кислотно-спиртовым покрытием

Окрашивание эндоспор

Первичная морилка — Малахитовый зеленый

Контркрашивание — сафранин

Эндоспоры устойчивы к окрашиванию основными красителями
Окраска эндоспор малахитовым зеленым; окрашивание вегетативных клеток сафранином

Пятно на капсуле (отрицательное окрашивание)

Использует кислотное краситель: (конго красный или нигрозин) и основное краситель: (кристаллический фиолетовый или сафранин)

Отрицательные пятна нельзя ни закрепить, ни смыть
Фон предметного стекла окрашен кислотными пятнами (капсула остается неокрашенной)
Клетки внутри капсулы окрашены красителями Basic
Примеры инкапсулированных клеток: Bacillus anthracis , Streptococcus pneumoniae и Klebsiella pneumonia

Пятно от жгутика

Нитрат серебра

Используется, чтобы увидеть бактериальные жгутики, которые слишком тонкие, чтобы их можно было увидеть с помощью других методов окрашивания
Нитрат серебра делает жгутики больше, чем они есть
Может использоваться для определения расположения жгутиков для идентификации.
- Пример: Proteus vulgaris с перитрихозными жгутиками

Пятно Spirochete

Нитрат серебра

Используется для визуализации тонких спирохет, таких как Treponema pallidum

Микроскопия

Создано Моникой З. Брукнер, Государственный университет Монтаны, Бозман

На этой микрофотографии, окрашенной по Гимзе, показан пример слегка кислого предметного стекла, на котором образовалось пятно розового цвета.На микрофотографии показаны клетки малярии. Фото любезно предоставлено библиотекой изображений общественного здравоохранения.

Что такое клеточное окрашивание?

Окрашивание клеток — это метод, который можно использовать для лучшей визуализации клеток и клеточных компонентов под микроскопом. Используя различные красители, можно предпочтительно окрашивать определенные компоненты клетки, такие как ядро или клеточную стенку, или целую клетку. Большинство красителей можно использовать для фиксированных или неживых клеток, в то время как только некоторые можно использовать для живых клеток; некоторые красители можно использовать как на живых, так и на неживых клетках.

Почему окрашивают клетки?

Основной причиной окрашивания клеток является улучшение визуализации клетки или определенных клеточных компонентов под микроскопом. Клетки также можно окрашивать, чтобы выделить метаболические процессы или различить живые и мертвые клетки в образце. Клетки также можно подсчитывать путем окрашивания клеток для определения биомассы в интересующей среде.

Как окрашиваются клетки и готовятся слайды?

Методы окрашивания и подготовка клеток зависят от типа окрашивания и используемого анализа.Для подготовки образца может потребоваться одна или несколько из следующих процедур:

Повышение проницаемости — обработка клеток, как правило, мягким поверхностно-активным веществом, которое растворяет клеточные мембраны, чтобы позволить более крупным молекулам красителя проникнуть внутрь клетки.
Fixation — служит для «фиксации» или сохранения морфологии клеток или тканей в процессе подготовки. Этот процесс может включать несколько этапов, но большинство процедур фиксации включают добавление химического фиксатора, который создает химические связи между белками для увеличения их жесткости.Обычные фиксаторы включают формальдегид, этанол, метанол и / или пикриновую кислоту.
Крепление — включает прикрепление образцов к предметному стеклу микроскопа для наблюдения и анализа. Клетки можно выращивать непосредственно на предметном стекле, либо свободные клетки можно наносить на предметное стекло с использованием стерильной техники. Тонкие срезы (срезы) материала, такого как ткань, также можно наносить на предметное стекло микроскопа для наблюдения.
Окрашивание — нанесение красителя на образец для окрашивания клеток, тканей, компонентов или метаболических процессов.Этот процесс может включать погружение образца (до или после фиксации или монтажа) в раствор красителя, а затем промывание и наблюдение образца под микроскопом. Некоторые красители требуют использования протравы, которая представляет собой химическое соединение, которое вступает в реакцию с пятном с образованием нерастворимого окрашенного осадка. Протравленное пятно останется на / в образце после смывания избытка раствора красителя.

Какие бывают распространенные пятна?

Существует несколько типов окрашивающих сред, каждый из которых может использоваться для разных целей.Ниже перечислены наиболее часто используемые пятна и их действие. Все эти красители можно использовать на фиксированных или неживых клетках, а те, которые можно использовать на живых клетках, отмечены.

Bismarck Brown — окрашивает кислотные муцины, тип белка, в желтый цвет и может использоваться для окрашивания живых клеток
Кармин — красит гликоген или животный крахмал, красный
Кумасси синий — окрашивает белки в бриллиантовый синий, часто используется в гель-электрофорезе
Кристаллический фиолетовый — окрашивает стенки клеток в пурпурный цвет в сочетании с протравой.Этот краситель используется при окрашивании по Граму
DAPI — флуоресцентное ядерное пятно, которое возбуждается ультрафиолетовым светом, демонстрируя синюю флуоресценцию при связывании с ДНК. DAPI можно использовать в живых фиксированных клетках
Эозин — контрастное окрашивание гематоксилину, окрашивает красные кровяные тельца, цитоплазматический материал, клеточные мембраны и внеклеточные структуры в розовый или красный цвет.
Бромид этидия — окрашивает нездоровые клетки на последних стадиях апоптоза, или преднамеренной гибели клеток, флуоресцентным красно-оранжевым цветом.
Fuchsin — это краситель используется для окрашивания коллагена, гладких мышц или митохондрий.
Гематоксилин — ядерный краситель, который с протравой окрашивает ядра в сине-фиолетовый или коричневый цвет.
Hoechst красит — два типа флуоресцентных красителей, 33258 и 33342, они используются для окрашивания ДНК в живых клетках.
Йод — используется как индикатор крахмала. В растворе крахмал и йод приобретают темно-синий цвет.
Малахитовый зеленый — сине-зеленый контраст сафранину при окрашивании по Гименесу на бактерии. Это краситель также можно использовать для окрашивания спор.
Метиленовый синий — окрашивает клетки животных, чтобы сделать ядра более заметными.
Нейтральный / толуиленовый красный — окрашивает ядра в красный цвет и может использоваться на живых клетках.
Нильский синий — окрашивает ядра в синий цвет и может использоваться на живых клетках.
Нильский красный / Нильский синий оксазон — это пятно получается путем кипячения нильского синего с серной кислотой, в результате чего получается смесь нильского красного и нильского синего.Красный цвет накапливается во внутриклеточных липидных глобулах, окрашивая их в красный цвет. Этот краситель можно использовать на живых клетках.
Тетроксид осмия — используется в оптической микроскопии для окрашивания липидов в черный цвет.
Родамин — белок-специфический флуоресцентный краситель, используемый в флуоресцентной микроскопии.
Safranin — ядерный краситель, используемый в качестве контрастного красителя или для окрашивания коллагена в желтый цвет.

После окрашивания клеток и подготовки слайдов их можно хранить в темноте и, возможно, охлаждать, чтобы сохранить окрашенные слайды, а затем наблюдать под микроскопом.

Ссылки по теме и преподавательская деятельность

Основные навыки микроскопии: учебные основы для пятен по Граму
В этом учебном упражнении используется пошаговый процесс, чтобы помочь студентам освоить использование микроскопа, а также повысить вероятность успеха, с которым они могут окрашивать и просмотреть микроорганизмы.
Активность по окрашиванию клеток сети научного обучения
Лабораторный протокол Мэрилендского университета для окрашивания по Граму
— эта страница из Университета Северной Каролины содержит ссылку на анимацию, показывающую, как работает окрашивание по Граму (метод, позволяющий различать две группы бактерий).
Примеры использования микроскопии — доступ к этому ресурсу был осуществлен через коллекцию цифровых ресурсов BioSciEd Net (BEN), которая представляет собой Путь Национальной научной цифровой библиотеки (NSDL) для образования в области биологических наук. Сам ресурс требует подписки или покупки активности на MicrobeLibrary.org. На этом веб-сайте есть три учебных примера (о биопленках, микробах в водоразделе и вспышке), в которых студентов просят анализировать и интерпретировать микроскопические изображения.
Компакт-диск с атласом MicrobeLibrary — Американское общество микробиологов (ASM), член коллаборации BEN, участвующих в программе NSDL Biological Sciences Pathway, только что выпустило компакт-диск с атласом MicrobeLibrary.Этот компакт-диск содержит 329 изображений, которые отображают результаты использования стандартных микробиологических протоколов и сред, таких как окрашивание по Граму, кровяной агар, агар МакКонки, трехкомпонентный сахарный железный агар и другие. Компакт-диск MicrobeLibrary Atlas можно приобрести за 18 долларов плюс стоимость доставки и транспортировки. Чтобы сделать заказ, посетите магазин ASM.

Оптимизированная техника окрашивания для обнаружения грамположительных и грамотрицательных бактерий в тканях | Примечания к исследованиям BMC

Предпосылки

Помимо метаболических функций кожи, иммунные и защитные возможности кожи помогают разделить внешнюю и внутреннюю среду организма [1].Кожная ткань — это первый физический барьер, предотвращающий проникновение микробов в подлежащие ткани хозяина. Когда этот барьер нарушается (например, после ожога), бактерии получают возможность колонизировать ткани, что впоследствии приводит к развитию инфекции. Большое количество различных типов как острых (например, укусы, царапины), так и хронических ран (например, ожогов, язв диабетической стопы) подвержены бактериальной инфекции [2, 3]. Примерно 7–10% всех госпитализированных пациентов страдают инфекциями кожи и мягких тканей [4].Бактериальная колонизация ран тормозит и продлевает заживление ран и усложняет клиническое ведение пациента [5]. Микроорганизмы могут существовать в ранах либо в виде отдельных бактерий, либо в виде прикрепленных к поверхности сообществ, известных как биопленки, заключенные в полимерную матрицу, состоящую из белков, ДНК и полисахаридов [6]. Состояние, в котором существуют эти микробы, может иметь прямое влияние на стратегии диагностики и лечения.

Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa , грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы соответственно, являются двумя условно-патогенными микроорганизмами, которые наиболее часто связаны с поврежденной тканью у пациентов [7, 8].Отчеты показывают, что S. aureus и P. aeruginosa играют решающую роль в колонизации до 93,5 и 52,2%, соответственно, пациентов с хроническими язвами ног и ожоговыми инфекциями [9]. Ожоговые раны особенно восприимчивы к бактериальным инфекциям из-за легкости доступа питательных веществ для колонизации [10]. В частности, ожоги приводят как к потере эпидермального слоя, так и к образованию мертвой ткани, известной как струп. Денатурированные белки и липиды в ожоговом струпе создают благоприятную среду для роста бактерий, в результате чего инфекция может распространяться системно и нарушать процесс заживления ран [11, 12].

Быстрая диагностика наличия бактерий необходима для успешного лечения инфицированных ран, а клинических признаков инфекции оказалось недостаточно [13]. Идентификация микробов с помощью традиционных методов культивирования ограничена и требует времени. Более того, по оценкам, только ~ 10% микроорганизмов могут быть успешно культивированы в лабораторных условиях, что позволяет предположить, что сама по себе культура недостаточно чувствительна [14]. Следовательно, метод выявления бактерий в инфицированных ранах, который является воспроизводимым и имеет быстрое время обработки, поможет в быстром и надлежащем лечении.Учитывая ограничения традиционного культивирования, передовые методы, использующие гистологические и молекулярные методы, оказались полезными [15–17]. Хотя молекулярные методы, такие как гибридизация in situ, ОТ-ПЦР (т. Е. Секвенирование 16S рРНК) или FACS, оказались более чувствительными, они связаны с высокими затратами и длительным временем сбора данных, а также с возможностью ложноположительных результатов (например, выявление неположительных результатов). -жизненные бактерии) [18–20]. Гистологически специфические антитела (т.е. иммуногистохимия) позволяют обнаруживать отдельные виды бактерий, включая S.aureus и P. aeruginosa . Несмотря на то, что таким способом можно определить виды бактерий, эти пятна также требуют больших затрат времени и средств. Кроме того, инфекции часто бывают полимикробными, и иммуногистохимия не позволяет идентифицировать множественные организмы [7, 21–23].

В недавних сообщениях рекомендуется использовать окраску гематоксилином и эозином (H&E) вместо окраски по Граму для обнаружения биопленок / бактерий в тканях [24, 25]. Однако, хотя существующие паттерны воспаления, выявленные с помощью H&E, могут дать некоторое представление об инфекционном статусе раны, отдельные бактерии нелегко обнаружить с помощью одного окрашивания H&E [26].Кроме того, окраска по Граму позволяет различать грамположительные и грамотрицательные бактерии и является наиболее часто используемым методом для классификации бактериальных мазков in vitro. Однако в срезах тканей необходимы адаптации этого метода (например, окрашивание по Браун-Бренну, метод Гудпастуре, окрашивание по Браун-Хоппсу, Штейнеру и Штайнеру), которые приводят к преимущественному распознаванию различных организмов. Эти модификации используют уникальные белковые профили в разных бактериях, однако белки, присутствующие в ткани хозяина, неспецифически окрашиваются в этих процессах окрашивания по Граму.Следовательно, различение бактерий становится невозможным, особенно в случаях ожоговых ран, в которых бактерии присутствуют в богатом белком струпе, который сохраняет неспецифические красители как в методах Грама, так и в методах H&E [15]. В этом исследовании мы использовали модель ожога свиньи, в которой раны были инокулированы либо S. aureus, либо P. aeruginosa из-за преобладания этих организмов в клинике. Гистологические срезы были взяты для сравнения традиционных гистологических окрашиваний (например, окрашивания H&E и по Граму) с новой модификацией традиционного окрашивания по Граму.В частности, в модификации использовалось контрастное окрашивание коллагена во время процесса дегидратации для сравнения грамположительных или грамотрицательных бактериальных колоний с коллагенсодержащей тканью. Наконец, мы проверили применимость этого метода окрашивания, выполнив его на клинических биопсиях пациентов, перенесших ожоговую санацию.

Методы

Бактериальные изоляты и условия роста in vitro

Метициллин-устойчивый изолят S. aureus был отобран из штамма USA300 в Институте хирургических исследований армии США (JBSA Fort Sam Houston, TX, USA). как часть ухода за пациентами, но не имеющая отношения к исследованиям. P. aeruginosa Штамм PA01 — это хорошо охарактеризованный раневой изолят, широко используемый в качестве лабораторного штамма [27–29]. S. aureus и P. aeruginosa выращивали при 37 ° C на чашках с кровяным агаром (Remel, Lenexa, KS), а затем отдельные колонии из кровяного агара инокулировали в бульон Мюллера-Хинтона с поправкой на катионы (MHB II) ( Бектон-Дикинсон, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси). Биопленки готовили, как описано ранее [30]. Вкратце, выращенные в средней логарифмической культуре бактерии (~ 10 ⁸ КОЕ / мл) разбавляли 1: 100 MHB II.Затем 250 мкл разведенных бактерий добавляли в отдельные лунки 24-луночного планшета и инкубировали в течение 48 ч при 37 ° C в статических условиях. После роста бактерии биопленки отделяли от 24-луночных планшетов путем комбинированной промывки стерильным PBS и механического разрушения с помощью пипетки. Бактериальные мазки готовили путем нанесения 50 мкл отслоившихся биопленок непосредственно на предметные стекла с последующей термофиксацией.

Сбор и обработка тканей

Это исследование было проведено в соответствии с Законом о благополучии животных, Правилами обеспечения благополучия животных и принципами Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.Протокол для животных A14-016 был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Института хирургических исследований армии США. Биопсии кожи с 11-го дня после ожога были любезно предоставлены из ранее описанной модели инфицированной ожогом свиньи, которая в настоящее время находится на рассмотрении [31]. Кроме того, человеческие образцы с удаленными ожогами были предоставлены в обезличенном виде Департаментом патологии хирургических исследований армии США. Использование человеческих образцов было одобрено институциональным регулирующим органом.Биопсии животных и человека фиксировали в 10% забуференном формалине в течение не менее 48 часов и обрабатывали в течение ночи возрастающими количествами этанола с последующими тремя промываниями ксилолом и последующим уравновешиванием в парафине. Затем ткани заключали в парафиновые блоки и разрезали на срезы 6 мкм. Предметные стекла депарафинизировали, очищали в ксилоле и регидратировали при подготовке к окрашиванию.

Методы окрашивания

Специфичность антител к S. aureus и P. aeruginosa была протестирована in vitro путем гидратации биопленки или мазков планктона сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS).Затем мазки блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в трис-буферном физиологическом растворе (TBS) с 0,1% Tween 20 и 0,1% Triton X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мазки инкубировали со следующими первичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре: S. aureus -FITC (разведение 1:50 в HBSS, ab68950, Abcam, Кембридж, Великобритания) или P. aeruginosa (разведение 1: 500 в HBSS, ab74980, Abcam, Кембридж, Великобритания). После инкубации P.aeruginosa промывали HBSS и зондировали вторичным антителом alexa-fluor 594 козьего антикурицы (разведение 1: 500, ab150176, Abcam) в течение 1 ч при комнатной температуре. Оба иммуноокрашивания были завершены тремя промывками в HBSS и впоследствии закреплены с использованием ProLong Gold с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Life Technologies, Grand Island, NY). В дополнение к специфическому окрашиванию антител in vitro использовали окрашивание по Граму с использованием стандартного протокола, описанного производителем (Remel, Lenexa, KS).

Для окрашивания нормальной кожи и биоптатов инфицированного ожога ex vivo получали серийные срезы тканей, как описано выше. Чтобы проверить наличие P. aeruginosa и S. aureus, на этих срезах была проведена иммуногистохимия , идентично тому, что описано выше для мазков in vitro. Кроме того, срезы окрашивали H&E (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) или красителем по Граму (Remel, Lenexa, KS). Окрашивание по Граму проводили аналогично описанным выше мазкам с небольшими изменениями (рис.1). Вкратце, кристаллический фиолетовый наносили на срезы ткани на 5 минут при комнатной температуре, а предметные стекла кратковременно ополаскивали проточной водой из-под крана для удаления излишков кристаллического фиолетового. Грамм-йодный протрав наносили на срезы тканей на 2 мин и ненадолго промывали водопроводной водой. Чтобы удалить любое неспецифическое окрашивание кристаллическим фиолетовым, на предметные стекла наносили обесцвечивающий растворитель по Граму на 30 с, затем быстро промывали проточной водопроводной водой до тех пор, пока вода не стала прозрачной. Затем срезы окрашивали грамм-сафранином в течение 1 мин и 40 с с последующей дегидратацией с помощью ряда спиртов (95–100%) до ксилола и затем закрывали покровным стеклом.

Рис. 1

Схема, показывающая модифицированную процедуру окрашивания по Граму. Традиционная процедура окрашивания по Граму завершается в любом случае (, верхний ящик, ). Основное различие в модифицированной процедуре окрашивания по Граму происходит во время процесса дегидратации и заключается в применении спиртового шафрана ( нижнее правое поле , выделено красным цветом ). Желтый контраст в соединительной ткани (коллагене) внутри кожной ткани виден на изображениях с низким увеличением внизу ( Масштабная полоса 1 мм)

Модифицированная техника окрашивания по Граму была выполнена таким же образом, как описано для окрашивания по Граму выше, с единственным добавлением контрастного красителя после первой стадии дегидратации 100% спиртом (рис.1). На этом этапе слайды погружали в спиртовой шафран (American Master Tech Scientific, Inc., Лоди, Калифорния) на 4 мин. После этой инкубации процесс дегидратации возобновляли, помещая предметные стекла обратно в 100% этанол, что также позволяло удалить избыток спиртового шафрана с последующей промывкой ксилолом и закрытием покровного стекла.

Микроскопия

Изображения полной биопсии раны (как свиньи, так и человека) получали с использованием сканера слайдов AxioScan Z1 (Carl Zeiss, Inc., Торнвуд, штат Нью-Йорк) при 10-кратном увеличении.Представляющие интерес области из серийных срезов получали с помощью микроскопа Olympus BX60, оснащенного камерой DP71 (Olympus Corporation, Токио, Япония). Были получены изображения в светлом поле, а также флуоресцентные изображения с использованием фильтров 594 нм ( P. aeruginosa ), 488 нм ( S. aureus ) или 405 нм (DAPI). Изображения с большим увеличением были получены с использованием 100-кратного объектива под масляной иммерсией.

Результаты и обсуждение

Окрашивание по Граму — наиболее распространенный метод окрашивания, используемый диагностически как в клинических условиях, так и в исследовательских лабораториях для дифференциации грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в различных типах тканей [17, 26].Как видно на фиг. 2, окрашивание по Граму in vitro S. aureus и P. aeruginosa позволяет легко дифференцировать эти два класса организмов in vitro. Более того, это различие все еще очевидно, когда применяется как к крупным агрегатам, так и к отдельным отделившимся бактериям внутри биопленок, несмотря на присутствие структур в полимерной матрице, таких как углеводы, липиды и белки, которые могут влиять на пятно [32]. Для более подробной классификации бактериальных штаммов, использованных в этом исследовании, используются антитела, специфичные к S.aureus или P. aeruginosa (т.е. иммуноцитохимия) использовались в качестве инструмента проверки. Как видно на фиг. 2c, d, проиллюстрированы формы бацилл и кокковых бактерий, демонстрирующие успешную идентификацию штаммов P. aeruginosa и S. aureus, соответственно.

Рис. 2

Проверка нанесенных красителей in vitro. Обычное окрашивание по Граму показывает идентификацию грамотрицательных ( a с.aeruginosa) и грамположительных (b S. aureus ) как в крупных агрегатах ( пунктирных линий, ), так и в отдельных бактериях внутри биопленки. Отобранные антитела к P. aeruginosa ( c ) и S. aureus ( d ) -антитела были использованы для подтверждения видовой идентичности культур, используемых для исследований ex vivo

Гистологически обнаружение бактериальных биопленок ex vivo осуществляется с помощью дорогих и трудоемких методов, таких как электронная микроскопия и конфокальная микроскопия [33, 34].Световая микроскопия используется для определения локализации биопленок в таких условиях, как риносинусит [24, 25, 35]. Однако в случае ожоговых ран неспецифическое окрашивание соединительной ткани, клеточного мусора и других белков, присутствующих в струпе, происходит из-за поглощения красителя кристаллического фиолетового, используемого при окрашивании по Граму [15]. Кроме того, поскольку струп содержит необходимые питательные вещества, поддерживающие рост бактерий, в этом месте часто встречаются бактерии-колонизаторы [11]. В этом исследовании мы использовали модель инфицированных ожогов на свинье, чтобы изучить модификацию традиционной окраски по Граму, которая обеспечивает контраст с соединительной тканью для лучшей визуализации бактерий.Свиньи — идеальный выбор для изучения кожных ран из-за их сходства с кожей человека. Например, кожа свиньи и кожа человека схожи по толщине эпидермиса и дермы, содержанию коллагена в папиллярном и ретикулярном слоях дермы, распределению волосяных фолликулов и схемам заживления (т.е. реэпителизации в отличие от сокращения) [36, 37].

Первоначально иммуногистохимия была проведена с ранее проверенными антителами для идентификации P. aeruginosa и S.aureus внутри ожоговой раны в этой модели (рис. 3). На рис. 3a, d показано, что эти бактерии отсутствуют в нормальной, необожженной коже свиньи. На рис. 3b мы демонстрируем, что специфическое антитело P. aeruginosa было способно обнаружить P. aeruginosa в инфицированных ожоговых ранах и визуализировано как скопления красных бацилл в поверхностных слоях кожи. Важно отметить, что реактивность антитела P. aeruginosa не наблюдалась ни в коже контрольной свиньи, ни в шкуре S.aureus инфицированных образцов (рис. 3а, в). Точно так же антитело S. aureus , специфически помеченное бактериями, повторно присутствует в инфицированной ткани S. aureus , визуализированной как зеленые кокки (рис. 3f), чего не было при ожогах, инфицированных P. aeruginosa (рис. 3c). Также было обнаружено, что локализация бактерий у этих двух видов различается. P. aeruginosa локализуется более поверхностно на ожоговом струпе, обычно в аэробной среде; тогда как S. aureus в основном располагался внутри / под струпом в более анаэробной среде.Примечательно, что это распределение S. aureus и P. aeruginosa согласуется с более ранними исследованиями, изучающими инвазивность этих микроорганизмов на других моделях [38–41].

Рис. 3

Визуализация успешной бактериальной инокуляции ex vivo. Иммуногистохимии подвергали нормальную кожу свиньи ( a , d ), инфицированных P. aeruginosa ( b , e ) и инфицированных S. aureus ( c , f ) кожи свиней. либо с P.aeruginosa ( a — c ) или S. aureus ( d — f ) антитела. Обратите внимание, что эти антитела позволяют специфично маркировать бактерии ex vivo, как показано стрелками , указывающими на уникальную бактериальную морфологию

Несмотря на эффективность иммуногистохимических методов, использование антител занимает много времени и дорого, а также требует предварительного знания видов бактерий, обитающих в интересующей ткани.Более того, большинство встречающихся раневых инфекций являются полимикробными. Клинически H&E является стандартным методом окрашивания, используемым патологами, и недавно он был использован для идентификации бактерий как в планктонной, так и в биопленочной формах внутри ран [24, 25]. Окрашивание H&E имеет несколько атрибутов, таких как доступность и быстрая обработка, а также способность выделять как клетки (гематоксилин), так и соединительную ткань (эозин). Однако удержание красителей, используемых в этом красителе, может привести к неправильной интерпретации сгустков и / или струпов в срезах тканей как бактерий.Как видно на рис. 4а, H&E эффективен для выделения структуры и морфологии ткани в нормальной коже свиньи с поверхностной ретикулярной дермой над характерными более толстыми волокнами папиллярной дермы. После термического повреждения H&E также эффективен для визуализации коагуляции коллагена в струпе (рис. 4b, c), поскольку отдельные волокна больше не видны. После инфицирования как P. aeruginosa (рис. 4b), так и S. aureus (рис. 4c), H&E становится неадекватным для четкой дифференциации бактериальных кластеров от остатков клеток-хозяев и компонентов струпа.Частично это связано с тем, что количество красителя, удерживаемого в срезе ткани, неспецифично (т. Е. Одни и те же области серийных срезов темнее после срезов H&E по сравнению с другими пятнами). Кроме того, окрашивание H&E не предназначено для различения грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Основываясь на этих наблюдениях, интерпретация окрашивания H&E в тканях может быть субъективной и приводить к неубедительным, если не ошибочным, диагнозам наличия или отсутствия бактерий.

Фиг.4

Модифицированное окрашивание по Граму улучшает обнаружение бактерий в срезах тканей. Последовательные срезы нормальной свиной кожи ( a , d , g ), P. aeruginosa, инфицированных ( b , e , h ) или S. aure us инфицированных ( c , f , i ) ожоговые раны окрашивали H&E, по Граму и по модифицированному Граму. H&E нормальной свиной кожи ( a ), инфицированных P. aeruginosa ( b ) и S.aureus , инфицированная кожа свиньи ( c ), демонстрирует коагуляцию ткани, однако окрашивание ожогового струпа не позволяет однозначно идентифицировать бактерии. Окрашивание по Граму позволяет легко дифференцировать кластеры как грамположительные или грамотрицательные бактерии ( e , f ), однако во всех образцах ткани отсутствуют. Этот недостаток контраста смягчается с помощью модифицированного окрашивания по Граму, которое заметно усиливает обнаружение бактериальных кластеров как грамотрицательных ( ч ) или грамположительных ( i )

.
Окрашивание по Граму также обычно используется как для in vitro, так и для клинических образцов, когда у пациентов собирают культуры для идентификации бактерий [42].Хотя окрашивание по Граму является быстрым, эффективным и недорогим методом бактериальной дифференциации, оно не позволяет визуализировать соединительную ткань (то есть коллаген) в гистологических образцах. Как видно на рис. 4d, как клеточные компоненты (например, ядра), так и волокна коллагена не видны в нормальной коже свиньи. Это в первую очередь связано с отсутствием контрастного красителя (например, красителя эозина при окрашивании гематоксилином и эозином), в котором контрастный краситель, используемый для соединительной ткани, был бы ценным для получения структурной информации.Окрашивание по Граму способно различать грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы ex vivo, как показано на рис. 4e, f. Однако также очевидно неспецифическое окрашивание поврежденной ткани, что в конечном итоге может переоценить бактериальную колонизацию в тканях. Эти наблюдения приводят нас к выводу, что, хотя окрашивание по Граму является стандартным методом окрашивания in vitro, его эффективность ex vivo может привести к субъективной интерпретации, а также не может проиллюстрировать важные аспекты морфологии ткани (т.э., коллаген).
Учитывая ограничения двух ранее описанных красителей, мы стремились разработать недорогое и быстрое дополнение к красителю по Граму, которое подчеркивает структуру ткани. Для этого мы модифицировали окраску по Граму, добавив спиртовой шафран в качестве контрастного красителя. Хотя о подобном окрашивании недавно сообщили Roche et al., Не было описания или оптимизации метода [43]. Спиртовой шафран традиционно использовался в других методах окрашивания (т.е., пентахром Мовата) [44] для выделения коллагеновых волокон в образцах тканей, включая обожженную кожу [45]. Как видно на рис. 4g, коллагеновые волокна в нормальной дерме окрашиваются в желтый цвет этим раствором, что дает структурную информацию, недоступную после одного окрашивания по Граму. В то время как структура коллагена значительно изменяется после ожога, о чем свидетельствует коагуляция, показанная на рис. 4h, i, спиртовой шафран сохраняет способность окрашивать коагулированный коллаген. Важно отметить, что эта модификация окраски по Граму сохраняет способность различать как грамположительные (рис.4h) и грамотрицательных (рис. 4i) микроорганизмов. Контраст, обеспечиваемый спиртовым шафраном, позволяет обнаруживать бактерии глубоко внутри ожогового струпа по сравнению с одним окрашиванием по Граму (рис. 4h, e). При малом увеличении модифицированное окрашивание по Граму дает представление о колонизации инфицированных тканей путем обнаружения различий в сохраненном красном / розовом ( P. aeruginosa ) или темно-фиолетовом ( S. aureus ). При большом увеличении также легко определить морфологию бактерий (то есть кокков и бацилл).
Чтобы проверить клиническую применимость модифицированной техники Грама, такое же сравнение окрашивания было проведено на хирургических биопсиях от неидентифицированного пациента (рис. 5). Критерии отбора для биопсии были для пациента, подвергавшегося ожоговой хирургии, у которого была выявлена полимикробная инфекция. При малом увеличении H&E, Gram и модифицированный Gram (рис. 5a, d, g, соответственно) выявили небольшое количество дермы, покрывающее значительную часть подкожных мышц.При более высоком увеличении окрашивание H&E показало задержку гематоксилина (пурпурный) как в коже (фиг. 5b), так и в мышцах (фиг. 5c) без легко идентифицируемой бактериальной морфологии. Следует отметить, что задержка красителя во время процесса окрашивания по Граму приводила к неспецифическому окрашиванию, особенно в скелетных мышцах (рис. 5f). Это было немного менее очевидно в дерме (рис. 5e), что позволило визуализировать бактерии в областях с менее плотной тканью хозяина. Однако большое увеличение модифицированного окрашивания по Граму ясно продемонстрировало бактериальную морфологию в соединительной ткани дермы (рис.5h) и подкожной мышцы (рис. 5i).
Рис. 5
Модифицированная окраска по Граму, применяемая для клинической хирургической биопсии. Серийные срезы ткани пациента, перенесшего ожоговую обработку раны, были окрашены тремя разными пятнами. Сканирование целых тканевых срезов с малым увеличением показывает небольшое количество дермы, покрывающей подкожную мышцу, с использованием красителей H&E ( a ), Грама ( b ) и модифицированного Грама ( c ). Более тщательное изучение окрашивания H&E в областях кожи ( b ) и мышц ( c ) выявило отсутствие жизнеспособных клеток-хозяев и мутные фиолетовые области.Более тщательное изучение окрашивания по Граму как в областях кожи ( e ), так и в мышцах ( f ) выявило некоторые области бактериальной морфологии, которые более очевидны там, где соединительная ткань хозяина более разрежена. Более тщательное изучение модифицированного окрашивания по Граму как на коже ( h ), так и на мышцах ( i ) показывает контрастное окрашивание, которое позволяет идентифицировать бактериальную морфологию ( стрелки ) в соединительной ткани. Увеличение врезок × 100
В то время как большое количество разнообразных молекулярных методов (например,g., пиросеквенирование 16S рРНК, гибридизация in situ, ОТ-ПЦР) уже доступны, потребуется время, прежде чем эти технологии станут достаточно усовершенствованными, чтобы они могли быстро развернуться и стать клинически осуществимыми. Тем не менее, в гистопатологии всегда найдется место для диагностики различных тканей, и желателен быстрый, недорогой, подробный и воспроизводимый гистологический метод для идентификации и локализации бактерий. Описанное нами модифицированное окрашивание по Граму улучшает традиционное окрашивание по Граму, обеспечивая контраст соединительных тканей.Оптимальное время инкубации этих тканей в спиртовом шафране составляет 4 мин. Меньшее время привело к более светлому окрашиванию соединительной ткани, в то время как более длительная инкубация в спирте начала удалять компоненты окраски по Граму. Эта 4-минутная инкубация представляет собой короткое добавление к процессу окрашивания, который уже используется в клинической практике. Хотя в этом исследовании мы использовали заливку парафином, обработка которой занимает несколько дней, стратегия мгновенного замораживания потенциально может позволить идентифицировать бактерии менее чем за час после взятия биопсии [46].
Есть потенциальные ограничения для применения этого красителя. Например, некоторые виды (например, грибы, кислотоустойчивые бактерии и другие бактерии с вариабельной грамм-переменной) не могут быть выделены с помощью окрашивания по Граму. Однако рассмотренные здесь приложения были направлены на борьбу с клинически значимыми видами бактерий, наиболее часто ассоциируемыми с раневыми инфекциями. Таким образом, эти наиболее распространенные виды, присутствующие в хронических незаживающих ранах, могут быть обнаружены с помощью описанной здесь методики. Кроме того, этот метод окрашивания не дает никаких доказательств наличия в ткани видов бактерий, которые необходимо будет устранить с помощью последующих диагностических инструментов.Кроме того, ткани, используемые в текущем исследовании, были оптимизированы для выявления инфекции, что может облегчить обнаружение по сравнению с меньшим количеством бактерий, которые могут присутствовать в острой ране. Определение того, выиграют ли раны с меньшим количеством бактерий от этого окрашивания, является предметом дальнейших исследований.
Выводы
Мы описали гистологический метод, который позволяет визуализировать тканевые структуры наряду с обнаружением грамположительных и грамотрицательных бактерий.Важным преимуществом модифицированного окрашивания по Граму является его способность выделять коллаген, что делает его применимым к любым тканям, содержащим коллаген. Использование этого метода в других образцах тканей, содержащих коллаген, может потребовать оптимизации времени окрашивания в зависимости от содержания коллагена в этом образце ткани. Поскольку кожная ткань очень богата плотными коллагеновыми волокнами, время окрашивания может быть даже короче для других тканей, в которых коллаген менее распространен и / или содержится в определенных местах (например,g., lamina propria). Мы продемонстрировали клиническую значимость этой модификации для окраски по Граму, поскольку она способна визуализировать бактерии в образцах ожоговой раны как из лаборатории, так и из операционной. В дальнейшем этот метод можно легко внедрить в клинике, что позволяет быстро исследовать статус инфекции в образцах тканей.
Окрашивание по Граму — StatPearls — Книжная полка NCBI
Введение
Окрашивание по Граму является одним из наиболее важных методов окрашивания в микробиологии.Он получил свое название от датского бактериолога Ганса Христиана Грэма, который впервые представил его в 1882 году, главным образом для выявления организмов, вызывающих пневмонию. [1] Часто при первом проведенном тесте окрашивание по Граму включает использование кристаллического фиолетового или метиленового синего в качестве основного цвета. [2] Термин для организмов, которые сохраняют основной цвет и кажутся пурпурно-коричневыми под микроскопом, — грамположительные организмы. Организмы, не поглощающие первичное окрашивание, под микроскопом выглядят красными и являются грамотрицательными организмами.
Первым этапом окрашивания по Граму является использование красителя кристаллического фиолетового для первоначального окрашивания предметных стекол. Следующий шаг, также известный как закрепление красителя, включает использование йода для образования кристаллического фиолетово-йодного комплекса, чтобы предотвратить легкое удаление красителя. Впоследствии для удаления красителя используется обесцвечивающее средство, часто растворитель этанол и ацетон. Основной принцип окрашивания по Граму заключается в способности клеточной стенки бактерий удерживать краситель кристаллического фиолетового во время обработки растворителем. [3] Грамположительные микроорганизмы имеют более высокое содержание пептидогликана, тогда как грамотрицательные микроорганизмы имеют более высокое содержание липидов.[4]
Первоначально все бактерии поглощают краситель кристаллический фиолетовый; однако при использовании растворителя липидный слой грамотрицательных организмов растворяется. С растворением липидного слоя грамнегативы теряют первичную окраску. Напротив, растворитель обезвоживает грамположительные клеточные стенки с закрытием пор, предотвращая диффузию фиолетово-йодного комплекса, и, таким образом, бактерии остаются окрашенными [5]. Продолжительность обесцвечивания является критическим этапом при окрашивании по Граму, поскольку длительное воздействие обесцвечивающего агента может удалить все пятна от обоих типов бактерий.[6]
Заключительный этап окрашивания по Граму заключается в использовании основного красителя фуксина для придания обесцвеченным грамотрицательным бактериям розового цвета для облегчения идентификации. Это также известно как контрастное пятно. Некоторые лаборатории используют сафранин в качестве контрастного красителя; однако основной фуксин окрашивает грамотрицательные организмы более интенсивно, чем сафранин. Аналогичным образом, Hemophilus spp., Legionella app и некоторые анаэробные бактерии плохо окрашиваются сафранином.
Сбор образцов
Для окрашивания по Граму можно использовать различные клинические образцы.Некоторые из обычно используемых образцов — это мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, асцитическая жидкость, синовиальная жидкость, плевральная жидкость, моча и т. Д. Также можно использовать мазки из ноздрей, горла, прямой кишки, раны, шейки матки и т. Д. Сбор образцов всегда должен производиться в стерильных контейнерах.
Процедуры
Типы оборудования, необходимого для окрашивания по Граму, включают:
Реагенты, необходимые для окрашивания по Граму, включают:
Кристаллический фиолетовый (первичное окрашивание) [1]
Раствор йода Грама (протрава) [1 ]
Ацетон / этанол (50:50 по объему) (обесцвечивающее средство) [1]
0.1% основной раствор фуксина (контрастный краситель) [1]
Вода
Процедура
1. Подготовка мазка на предметном стекле:
Посевная петля используется для переноса капли суспендированной культуры на предметное стекло микроскопа.
Если в чашке Петри или наклонной культуральной пробирке есть колония, добавляют каплю или несколько петель воды, чтобы облегчить перенос минимального количества колонии на предметное стекло.
Требуется минимальное количество культуры. Если культура может быть обнаружена визуально на петле посева, это указывает на сбор слишком большого количества культуры.
Культура распределяется с помощью петли для посева до однородной тонкой пленки по кругу диаметром 15 мм. Типичный слайд может содержать до 4 небольших мазков, если исследуется более одной культуры.
Слайд можно сушить на воздухе или сушить с помощью тепла на слабом огне.Ползун следует перемещать круговыми движениями над пламенем, чтобы предотвратить перегрев или образование кольцевых узоров на ползуне. Тепло способствует прилипанию клеток к предметному стеклу и предотвращает значительную потерю культуры во время ополаскивания.
2. Окрашивание по Граму:
К фиксированной культуре добавляют краситель кристаллическим фиолетовым.
Через 10–60 секунд пятно сливается, а излишки пятна смываются водой. Цель — смыть пятно без потери закрепленной культуры.
Раствор йода используется для покрытия мазка на 10-60 секунд. Этот шаг известен как «закрепление красителя». Раствор йода сливают, предметное стекло ополаскивают проточной водой. Лишняя вода с поверхности стряхивается. [7]
На предметное стекло добавлено несколько капель обесцвечивающего средства. Обесцвечивающие средства часто представляют собой смешанный растворитель этанола и ацетона. Этот этап известен как «обработка растворителем». Предметное стекло ополаскивают водой в течение 5 секунд. Чтобы предотвратить чрезмерное обесцвечивание грамположительных клеток, прекратите добавлять обесцвечивающее средство, как только растворитель перестанет окрашиваться, когда он течет по слайду.
Мазок окрашивают основным раствором фуксина в течение 40-60 секунд. Раствор фуксина смывается водой, а избыток воды промокается бибулярной бумагой. Слайд также можно сушить на воздухе после стряхивания лишней воды.
3. Исследование предметного стекла под микроскопом:
Предметное стекло необходимо исследовать под микроскопом в масляной иммерсии.
При первичном исследовании предметных стекол следует использовать объектив X40 для оценки распределения мазков, а затем их следует исследовать с помощью масляного иммерсионного объектива X100.
Все области слайда требуют первичного осмотра. Следует исследовать участки толщиной всего в одну ячейку. Толстые области на слайдах часто дают переменные и неверные результаты.
Лейкоциты и макрофаги окрашивают грамотрицательные клетки.
Клетки плоского эпителия окрашивают грамположительные.
Используются различные модификации окрашивания по Граму, такие как окрашивание по Граму Аткин, окрашивание по Граму Берк и т. Д.
Показания
Окрашивание по Граму показано при подозрении на бактериальную инфекцию для облегчения и ранней диагностики.[8]
Возможный диагноз
Окрашивание по Граму помогает в диагностике заболевания или патологического состояния.
Примеры грамположительных организмов:
Кокки: видов Staphylococcus и Streptococcus видов
Bacilli: Corynebacterium видов и видов Clostridia видов Clostridium, видов Clostridium
Примеры грамотрицательных микроорганизмов: [9]:
Кокки: Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, и Moraxella видов
Bacilli: Escherichia спираль, видов, Pseudomonas видов, Pseudomonas и Klebsiella видов
Примеры микроорганизмов с грамм-переменными включают:
Actinomyces видов
Нормальные и критические результаты
Нормальным обнаружением в стерильной биологической жидкости должно быть отсутствие каких-либо патологических организмов. в мазке.Организмы идентифицируются по цвету и форме. Грамположительные организмы имеют фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные — розовый или красный цвет. Бациллы палочковидные, а кокки сферические.
Результаты окрашивания по Граму, которые указывают на лежащие в основе бактериальные инфекции:
Грамположительные кокки в скоплениях: Обычно характерны для видов Staphylococcus , таких как S. aureus.
Грамположительные кокки в цепочках: обычно характерны для Streptococcus видов, таких как S.pneumoniae, стрептококки группы В
Грамположительные кокки в тетрадках: Обычно характерны для Micrococcus spp.
Грамположительные бациллы, толстые: обычно характерны для Clostridium spp., Таких как C. perfringes , C. septicum .
Грамположительные бациллы, тонкие: Обычно характерны для Listeria spp.
Разветвленные грамположительные палочки: обычно характерны для Actinomyces и Nocardia .
Грамотрицательные диплококки: Обычно характерны для видов Neisseria , таких как N. meningitidis .
(Обратите внимание: Moraxella spp. И Acinetobacter spp., Часто являются диплококками по морфологии. Acinetobacter иногда могут проявляться как грамположительные кокки, а могут быть плеоморфными.
359 Coccobacill : Обычно характерен для Acinetobacter spp., И они могут быть грамположительными, грамотрицательными или грамположительными.
Грамотрицательные бациллы, тонкие: обычно характерны для Enterobacteriaceae , таких как E. coli .
Коккобациллы: Обычно характерны для Hemophilus spp., Таких как H. influenzae .
Изогнутый: Обычно характерен для Vibrio spp.,; Campylobacter spp., Например V. cholerae и C. jejuni .
Форма тонкой иглы: Обычно характерна для Fusobacterium spp.
Организмы с грамотрицательными изменениями: эти организмы не подразделяются ни на грамположительные, ни на грамотрицательные.
Мешающие факторы
Если образец не является стерильным, образец может быть заражен множеством организмов. Точно так же неправильный сбор образцов и предварительное использование антибиотиков могут помешать росту организмов. Во время интерпретации окраски по Граму, как описано Всемирной организацией здравоохранения в 2003 году, необходимо выполнить следующие шаги:
1.Общий характер мазка требует анализа при малом увеличении (10X)
Фон слайда должен быть грамотрицательным или прозрачным
Белые кровяные тельца, если они есть, должны окрашивать грамотрицательные
Тонкие осадки кристаллического фиолетового или горечавки не следует путать с грамположительными бактериями палочки
Мазок должен быть толщиной в одну клетку без перекрытия клеток
2.Следует использовать малое увеличение, чтобы отметить следующее:
Относительное количество полиморфноядерных нейтрофилов (PMN), мононуклеарных клеток и эритроцитов (RBC)
Относительное количество плоских эпителиальных клеток и нормальных микробиотических бактерий
Расположение, расположение и форма организмов
3. При обследовании нескольких месторождений иммерсией в масле необходимо обратить внимание на следующее:
Микроорганизмы: если идентифицированы, обратите внимание на номера и морфологию
Формы: кокковая, палочка, коккобацилла, нитевидные и дрожжевые
Внешний вид концов: закругленные, конические, вогнутые, булавовидные и приплюснутые
Внешний вид сторон: параллельные, яйцевидные, неправильные или вогнутая
Ось организма: прямая, изогнутая или спиральная
Плеом орфизм (изменение формы)
Разветвление или разрастание клеток
Осложнения
Интерпретация слайдов может быть затруднена, если микроскопический мазок толстый и комковатый.Время обесцвечивания следует тщательно контролировать, чтобы избежать обесцвечивания или чрезмерного обесцвечивания. Более густые мазки требуют более длительного времени обесцвечивания. Точно так же следует проводить оценку еще свежих культур. Старые культуры имеют тенденцию терять клеточные стенки пептидогликана, что предрасполагает грамположительные клетки к грамотрицательным или грамположительным. Окрашивание по Граму бесполезно для организмов без клеточной стенки, таких как виды Mycoplasma , и для более мелких бактерий, таких как виды Chlamydia и Rickettsia .
Окрашивание по Граму не может ложно выявить микроорганизмы в следующем сценарии:
Использование антибиотиков перед забором образца
Несоответствующий возраст посева: слишком молодой или слишком старый
Фиксация мазка перед сбором образца сухой
Мазок слишком толстый
Низкая концентрация кристаллического фиолетового
Чрезмерная фиксация тепла
Чрезмерная промывка между этапами
Недостаточное воздействие йода
8 Длительное обесцвечивание
Чрезмерное контрастное окрашивание
Отсутствие опыта в подготовке слайдов и просмотре слайдов
Иногда результаты окрашивания по Граму могут не совпадать с окончательными результатами посева и потенциально могут привести к неправильному использованию антибиотиков.[10]
Клиническая значимость
Окраска по Граму часто является первоначальным диагностическим тестом для оценки инфекций. Использование окраски по Граму способствует быстрому применению соответствующих антибиотиков. Однако генетические последовательности и молекулярные методы более специфичны, чем классическое окрашивание по Граму.
Дополнительное образование / Контрольные вопросы
Ссылки
1.
БАРТОЛОМЬЮ JW, MITTWER T. Окрашивание по Граму. Bacteriol Rev.1952 Март; 16 (1): 1-29. [Бесплатная статья PMC: PMC180726] [PubMed: 14925025]
2.
О’Тул, Джорджия. Classic Spotlight: как работает пятно по Граму. J Bacteriol. 2016, 01 декабря; 198 (23): 3128. [Бесплатная статья PMC: PMC5105892] [PubMed: 27815540]
3.
LIBENSON L, McILROY AP. О механизме образования пятен по Граму. J Infect Dis. 1955 июль-август; 97 (1): 22-6. [PubMed: 13242849]
4.
SHUGAR D, BARANOWSKA J. Исследования окраски по Граму; важность белков в реакции Грама. Acta Microbiol Pol (1952). 1954; 3 (1): 11-20. [PubMed: 13147751]
5.
HASLETT AS. Химическое значение теста Грама для бактерий. Aust J Sci. 1947, 21 июня; 9 (6): 211. [PubMed: 20255991]
6.
Попеску А., Дойл Р.Дж. Окраска по Граму спустя более века. Biotech Histochem. 1996 Май; 71 (3): 145-51. [PubMed: 8724440]
7.
MITTWER T, BARTHOLOMEW JW, KALLMAN BJ. Механизм граммовой реакции. II. Функция йода в пятне по Граму. Stain Technol. 1950 Октябрь; 25 (4): 169-79. [PubMed: 14782050]
8.
Уилсон М.Л. Клинически значимая, экономичная клиническая микробиология. Стратегии уменьшения ненужного тестирования. Am J Clin Pathol. 1997 Февраль; 107 (2): 154-67. [PubMed: 64]
9.
Beveridge TJ, Davies JA. Клеточные ответы Bacillus subtilis и Escherichia coli на окрашивание по Граму. J Bacteriol. 1983 ноябрь; 156 (2): 846-58. [Бесплатная статья PMC: PMC217903] [PubMed: 6195148]
10.
Rand KH, Tillan M. Ошибки в интерпретации окрашивания по Граму из положительных культур крови.Am J Clin Pathol. 2006 ноябрь; 126 (5): 686-90. [PubMed: 17050065]
Модернизация методов окрашивания по Гольджи для получения трехмерного изображения отдельных нейронов с высоким разрешением
Животные
Все эксперименты на животных были одобрены Этическим комитетом KU Leuven (протокол P138 / 2017) и выполнены в соответствии с директивами Комитета по защите животных KU Leuven, Бельгия. Всего пятьдесят семь самцов и самок мышей C57BL / 6 в возрасте 4–6 недель для Golgi-Cox и исходной Golgi и две самки APP ^NL-GF, 25-месячных трансгенных мышей двух возрастных категорий. использовались соответствующие контрольные самки дикого типа.Животных умерщвляли смесью кетамина и ксилазина в соответствии с инструкциями учреждения.
Мышам транскардиально перфузировали 10 мл 0,9% хлорида натрия (# S7653, Sigma-Aldrich, Бельгия) в бидистиллированной воде (dH ₂ O) в течение 10 минут для Гольджи-Кокса, затем 10 мл в течение 10 минут. 4% PFA (№ 15714, EMS, США) в 0,1 М фосфатном буфере (PB), pH 7,4. Для первоначального окрашивания по Гольджи стадия хлорида натрия была пропущена. Мозги были постфиксированы в течение ночи для исходного Гольджи или на 1 час для Гольджи-Кокса при 4 ° C.В некоторых экспериментах были изготовлены срезы коронального вибратома толщиной 100–500 мкм. Как правило, для визуализации с помощью световой микроскопии толщина срезов вибратома составляла от 100 до 500 мкм, для электронной микроскопии от 100 до 200 мкм и для Гольджи в сочетании с очисткой тканей 150-500 мкм.
Окрашивание по Гольджи-Коксу для LM
После трех промывок в 0,1 M PB срезы или тканевые блоки свободно плавали в растворе Гольджи-Кокса (см. Ниже) при комнатной температуре (RT) в течение 15–45 дней (см. Подробности в тексте). ), во тьме.Затем срезы или блоки промывали два раза в течение 5 минут dH ₂ O, переносили в 28% гидроксид аммония (# 221228, Sigma-Aldrich, Бельгия) в dH ₂ O и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с вращение. После двухкратной промывки в течение 5 минут с помощью dH ₂ O срезы инкубировали в 15% растворе Kodak Carestream Fixer (# P6557, Sigma-Aldrich, Бельгия) в dH ₂ O в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем два раза. 5-минутная промывка dH ₂ O. Блоки мозга после инкубации в 28% гидроксиде аммония в течение 60 минут и промывки dH ₂ O помещали в 3% агарозу в dH ₂ O и вибратоме толщиной 150–300 мкм. были сделаны разделы.Срезы инкубировали в 15% растворе Kodak Carestream Fixer в dH ₂ O в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим нанесением на покрытые желатином предметные стекла для микроскопии, сушили при комнатной температуре и покрывали покровными стеклами в монтажной среде Mowiol (# 81381- 50 G, Sigma-Aldrich). Целые срезы визуализировали с помощью стереомикроскопа Zeiss, а клетки / шипы визуализировали с помощью широкоугольного микроскопа Zeiss Axioplan 2 с использованием объектива с 20-кратным и 40-кратным увеличением.
Раствор Гольджи-Кокса представляет собой смесь трех компонентов: (A) 5% дихромат калия в dH ₂ O (# P5271, Sigma-Aldrich, Бельгия), (B) 5% хлорид ртути (# KK04.1, Carl Roth GmbH, Германия) в dH ₂ O, растворенном при нагревании до 60 ° C, и (C) 5% хромат калия в dH ₂ O (# HN33.1, Carl Roth GmbH, Германия). Сначала 50 мл раствора RT A смешивают с 50 мл раствора B. RT, затем 40 мл раствора RT C смешивают со 100 мл dH ₂ O и медленно добавляют к смеси при перемешивании. После перемешивания в течение дополнительных 2–5 мин раствор накрывают алюминиевой фольгой и оставляют при комнатной температуре на ночь, после чего образуется красно-желтый осадок.Раствор осторожно аспирируют, оставляя осадок и поверхностный слой нетронутыми, пропускают через фильтр 0,2 мкм и используют в течение 20–30 дней после приготовления.
Оригинальное окрашивание по Гольджи для LM и EM
Срезы вибратома размером 100–200 мкм или блоки мозга трижды промывали 0,1 M PB и инкубировали в течение десяти дней в 3,5% бихромате калия в dH. ₂ O при комнатной температуре в темноте. свободное плавание. Затем 5–6 срезов собирали мягкой кистью для рисования (серия 150, размер 1; Talens, Нидерланды) на предметные стекла микроскопа и закрывали покровными стеклами размером 22 × 22 мм, углы которых были погружены в коммерческий цианоакрилатный клей.«Сэндвич» и фрагменты мозга помещали в сосуды Коплина объемом 250 мл, полностью заполненные 1% нитратом серебра (# RT210560, EMS, USA) в dH ₂ О. Через три дня при 37 ° C в темноте окрашивание проверяли с помощью широкопольного светового микроскопа и, если окрашивание оказывалось недостаточным, инкубацию в 1% нитрате серебра продлевали.
Следующие шаги относятся к разделам. После снятия срезов с предметных стекол и промывки их в 0,1 M PB осадки были удалены, осторожно соскребая поверхность срезов малярной кистью в 0.1 МБ (дополнительное видео 1). Срезы можно хранить в 0,1 M PB при 4 ° C до получения изображений с помощью широкоугольного светового микроскопа для выбора окрашенных нейронов. Все срезы были получены с помощью микроскопа Zeiss Elyra S.1 с 4-кратным объективом (рис. 6а и 7а). Затем секции были обрезаны до размера прибл. 1 мм² вокруг интересующего нейрона, желательно таким образом, чтобы можно было легко ориентировать обрезанный образец (рис. 6a – c и рис. 7a – c), а интересующие области были визуализированы с помощью Zeiss Elyra S.1 микроскоп с 4-кратным объективом.
Обрезанные срезы трижды промывали в dH ₂ O в течение 10 минут с последующей инкубацией в 0,05% хлориде золота (# RT16586, EMS, USA) в dH ₂ O при 4 ° C в темноте при перемешивании. на 40 мин (для лучшей сохранности ультраструктурных деталей) или на 60 мин (для более легкого отслеживания), и от 30 до 60 мин для этапа очистки. Образцы снова трижды промывали в течение 10 минут ледяной водой dH ₂ O, инкубировали в течение 10 минут в ледяной атмосфере 0.5% щавелевая кислота (# 241172, Sigma-Aldrich, Бельгия), трижды промывали ледяной dH ₂ O в течение 10 мин и инкубировали в 1% тиосульфате натрия (# RT21360, EMS, США) при 4 ° C. с вращением в течение ночи. Срезы (z-стек) получали с помощью микроскопа Zeiss Elyra S.1 с дифференциальным интерференционным контрастом (ДИК) с использованием объективов 4x и 40x.
Затем образцы окрашивали 1% тетроксидом осмия (# 19152, EMS, США) и 1,5% ферроцианидом калия (# 455989, Sigma-Aldrich, Бельгия) в течение 1 ч, затем 0.2% дубильной кислоты (# 21700, EMS, США) и снова 1% четырехокиси осмия при комнатной температуре в течение 30 мин с промывками в dH ₂ O между стадиями. Затем образцы инкубировали в 0,5% уранилацетате (# 22400, EMS, США) в 25% метаноле в течение ночи при 4 ° C и окрашивали en bloc аспартатом свинца Уолтона ³² в течение 30 минут при 60 ° C. После промывки dH ₂ O образцы дегидратировали в восходящей серии этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 95%, 100%), 10 мин на шаг при 4 ° C. Образцы дважды обрабатывали пропиленоксидом по 10 мин при комнатной температуре и пропитывали твердыми смесями Epon 812 / пропиленоксид.На следующий день срезы помещали в твердую композицию Epon 812 (№ 14120, EMS, США) между двумя предметными стеклами микроскопа и пленкой ACLAR (№ 50425, EMS, США) и полимеризовали в течение 2 дней при 60 ° C.
Для отслеживания импрегнированных нейронов в объеме образцы, окрашенные в золото в течение 60 минут, получали с помощью сканирующего электронного микроскопа Zeiss Sigma Variable Pressure (Zeiss, Германия), оборудованного встроенным ультрамикротомом (Gatan, 3View, Франция). Плоские заделанные секции монтировались на алюминиевые штыревые штыри (Gatan, Франция) с проводящей эпоксидной смолой (Circuit Works, # 16043, Ted Pella, Германия).Интересующие нейроны могут быть локализованы на основе окрашивания и визуализации LM, а также геометрии соседних кровеносных сосудов. После приближения к интересующему пропитанному нейрону производили серийное срезы с шагом 200 нм. Это приращение было выбрано для облегчения визуализации всего объема нейронов, необходимого для отслеживания, с разумной скоростью. Кроме того, разделение больших образцов с шагом z ниже определенного порога приводит к артефактам изображения, возникающим из-за накопления локального отрицательного заряда, когда глубина проникновения электронного зонда превышает толщину сечения.Связанные с этим и, возможно, из-за резистивного нагрева смолы или других изменений смолы, могут возникать артефакты секционирования, такие как неполное секционирование или пропуск секций. Мы не наблюдали каких-либо явных различий в дендритной морфологии импрегнированных нейронов при использовании 200 нм против 100 нм (стандартная толщина для ПЭМ) в пилотных исследованиях (данные не показаны). При необходимости можно использовать меньшие z-шаги, но может потребоваться дополнительная оптимизация.
Последовательные электронные микроскопические изображения половины объема импрегнированного нейрона были получены в 1.3 кВ с полем зрения 200 × 200 мкм при времени выдержки 2 мкс, 0,012 мкм / пиксель (время визуализации составляло 6 минут на секцию). Затем, чтобы восстановить синапсы, связанные с импрегнированным нейроном (дополнительное видео 4), блок удаляли из микроскопа, как только интересующая область была идентифицирована для ручного сечения импрегнированного нейрона толщиной 2–5 мкм и после ручного разрезания возвращалась в BF-SEM. для отображаемого остального объема с такими же параметрами. Изображения BF-SEM были совмещены с использованием программного обеспечения Digital Micrograph (Gatan).Мы разработали полуавтоматический алгоритм сегментации нейронов, отображаемых в стеке (см. Ниже и дополнительное видео 3). Реконструкция сегментированных нейронов выполнялась с помощью программного обеспечения Amira (FEI / Thermo Fisher Scientific, Франция), сегментация и реконструкция синапсов импрегнированного нейрона также выполнялась с помощью программного обеспечения Amira.
Для наблюдения ультраструктурных деталей импрегнированных нейронов с высоким разрешением блоки, содержащие образцы, окрашенные золотом в течение 40 минут, удаляли из микроскопа, как только интересующая область была идентифицирована с помощью BF-SEM (рис.6). Серийные ультратонкие срезы получали вручную с использованием ультрамикротома Reichert Ultracut E. Все срезы были собраны в виде лент из 4–5 сечений на сетке с тремя пазами (Ted Pella, Германия). Изображения получали на микроскопе ТЕМ (JEM1400-LaB6, JEOL, Япония), работающем при 80 кВ. ПЭМ был оснащен камерой Olympus SIS Quemesa 11 МП. Фотографии были сделаны при разном увеличении (0,6–20кх).
Очищение по Гольджи для LM с использованием метода CUBIC
После окрашивания по Гольджи-Коксу и Гольджи образцы (срезы или блоки головного мозга) были очищены с использованием протокола CUBIC.Для образцов, окрашенных по Гольджи-Коксу, очищение тканей начинали после инкубации с 15% фиксатором Kodak, а для исходных образцов, окрашенных по Гольджи, после 0,05% хлорида золота в течение 30–60 мин. Образцы промывали трижды в dH ₂ O в течение 10 мин с последующей инкубацией в растворе CUBIC: 250 г / л мочевины (№ 821527, ICN Biomedicals, США), 250 г / л Quadrol (№ 122262, Sigma-Aldrich. , Бельгия) и 150 г / л Triton X-100 (# RT22140, EMS, USA), последовательно растворенных в dH ₂ O при нагревании и перемешивании и охлажденных до комнатной температуры).Образцы, окрашенные по Гольджи-Коксу, инкубировали в течение 10 мин — 8 дней (см. Текст) в смеси равных частей раствора CUBIC и dH ₂ O при 37 ° C в темноте при перемешивании. Исходные образцы, окрашенные по Гольджи, были отправлены по тому же протоколу CUBIC, и инкубация продолжалась до достижения желаемого уровня очистки тканей, 1-21 день (см. Текст).
Образцы были визуализированы непосредственно в очищающих растворах. Трехмерные световые микроскопические изображения были получены с помощью устройства Bioptonics OPT (рис. 3k, l и дополнительное видео 2) или вращающегося диска Nikon, конфокального с помощью объектива CFI Plan Apo 10XC Glyc для очистки приложений (рис.3д, е). Целые образцы были получены с помощью стереомикроскопа Zeiss (рис. 3a – d, g – j).
Гольджи-Кокса и флуоресцентное окрашивание для LM
Срезы пропитывали протоколом Гольджи-Кокса, как указано выше. После стадии гидроксида аммония и двухкратной промывки в течение 5 минут dH ₂ O срезы окрашивали 0,05% тиофлавином-S (# T1892-25G, Sigma-Aldrich, Бельгия) в 50% метаноле в течение 20 минут с осторожным волнение в темноте. Образцы дважды промывали dH ₂ O в течение 5 минут, инкубировали в фиксаторе Kodak в течение 10 минут и дважды промывали перед очисткой по протоколу CUBIC в течение 10 минут.Срезы были закреплены в последней смене раствора CUBIC и визуализированы с помощью широкопольной флуоресценции Zeiss Axioplan 2 с объективом 5x и 40x (рис. 5a – c).
Плагин ImageJ для сегментации ЭМ-изображений, окрашенных Гольджи
Инструмент GolgiStain — это плагин для ImageJ2 (http://imagej.net/) или Fiji2 (https://fiji.sc/), который можно загрузить по адресу http://bioimagingcore.be/plugin/golgi-stain-1.2.0.jar. Он работает на всех системах, поддерживаемых ImageJ2. Чтобы установить последнюю версию GolgiStain, добавьте сайт GolgiStain в свой список сайтов обновлений ImageJ следующим образом: (1) в меню ImageJ выберите Справка ▶ Обновить …, (2) затем нажмите Управление сайтами обновлений , ( 3) нажмите Добавить сайт обновления , заполните http: // sites.imagej.net/GolgiStain/ в качестве URL-адреса, укажите имя (например, GolgiStain), убедитесь, что флажок установлен, нажмите Закрыть и, наконец (4) нажмите Применить изменения и перезапустите ImageJ. Альтернативный метод установки — перетащить файл golgi-Stain-1.2.0-.jar в каталог плагина ImageJ; в этом случае обновления плагина также необходимо будет выполнить вручную.
Инструкции по быстрому запуску
(1) Загрузите набор данных в ImageJ. Набор данных должен быть 8- или 16-битным изображением в градациях серого или стеком изображений.(2) Запустите плагин GolgiStain из меню: Плагины ▶ GolgiStain. Появится окно плагина с полями для ввода параметров сегментации. (3) Настройте параметры сегментации (см. Дополнительное видео 3). Если установлен флажок Предварительный просмотр, появится красный оверлей, показывающий результат сегментации. Для стеков изображений срез, который будет использоваться для предварительного просмотра сегментации, можно указать с помощью поля ввода Slice # for Preview . (4) Нажмите OK, чтобы выполнить сегментацию изображения или всей стопки изображений.Если установлен флажок Mask Segmentation Only , каждый фрагмент на выходе будет двоичной маской; в противном случае создается многоканальный выходной сигнал, в котором канал 1 является исходными данными, а канал 2 является маской.
Плагин выполняет сегментацию изображений с помощью конвейера простых операций. Поскольку частицы пятна Гольджи очень плотные, их можно легко идентифицировать на изображении с помощью простого определения порога. Соседние частицы затем объединяются в смежные области с помощью комбинации морфологического закрытия и размытия по Гауссу (морфологическое закрытие эффективно соединяет соседние частицы и закрывает дыры, но приводит к резким неровным контурам области, последующее размытие по Гауссу с последующим пороговым размытием сглаживает контуры области.). Полученное изображение затем снова подвергается пороговой обработке для извлечения двоичных масок для окрашенных областей. Наконец, небольшие изолированные окрашивающие частицы можно удалить путем фильтрации областей по площади.
Описание параметров сегментации
Макс. Интенсивность окрашивания частиц : пороговое значение, которое будет использоваться для определения того, какие пиксели считаются гранулами пятна Гольджи. Только пиксели с интенсивностью от 0 до введенного значения считаются окрашивающими частицами; все остальные пиксели «отбрасываются».
Радиус закрытия (в пикселях) : Степень морфологического закрытия. Все частицы, находящиеся на таком расстоянии друг от друга, будут объединены.
Расстояние размытия (в пикселях) : Размер размытия по Гауссу. Его эффект заключается в сглаживании контуров областей сегментации.
Мин. Интенсивность сегмента : Пороговое значение интенсивности пикселя, используемое для выделения фактических областей сегментации после размытия по Гауссу.Маленькие значения приведут к сегментации, когда границы области будут слишком далеко от окрашивающих частиц, тогда как слишком большие значения приведут к отсоединенным областям. Первоначально установите это значение на 1, оптимизируя другие параметры. Как только будет достигнута разумная сегментация, это значение можно постепенно увеличивать, чтобы приблизить границы области к окрашивающим частицам.
Мин. Размер сегмента (в пикселях) : это минимальная область (в количестве пикселей) для области, которая должна быть разрешена в окончательном выводе сегментации.Он используется для удаления крошечных изолированных, окрашенных участков. Лучше всего изначально установить значение 0, чтобы избежать случайного подавления соответствующих областей сегментации. После того, как все другие параметры оптимизированы, это значение может (необязательно) быть увеличено для удаления, например, областей, которые предположительно являются неспецифическими.
Только маска сегментации : Если этот флажок установлен, на выходе будет маска двоичной сегментации.Если этот флажок не установлен, на выходе будет двухканальное изображение (стек), где канал 1 — исходные данные, а канал 2 — маска сегментации. Двухканальный вывод очень удобен для проверки результата сегментации, но требует больше памяти компьютера. Двоичный вывод также может быть предпочтительным для дальнейшей обработки, такой как 3D-реконструкции.
Непрозрачность предварительного просмотра (в%) : процент непрозрачности, установленный для наложения предварительного просмотра, чем выше, тем непрозрачнее.
Номер фрагмента для предварительного просмотра : Номер фрагмента, для которого необходимо просмотреть результат сегментации. Он используется для стопки изображений (> 1 изображение).
Предварительный просмотр : Если этот флажок установлен, оверлей предварительного просмотра будет пересчитываться и перерисовываться каждый раз, когда пользователь изменяет параметр сегментации и нажимает Введите .
Подробности алгоритма
Конвейер сегментации состоит из следующей последовательности шагов обработки изображения (рис. 8).
(1)
Выполняется начальный порог. Для всех пикселей между 0 и пороговым значением T ₁, введенным пользователем, устанавливается максимальная интенсивность пикселей 2 ^b — 1, для остальных — 0.{b} -1 \, {\ rm {иначе}} \ end {array} $$
(2)
Операция морфологического закрытия применяется к двоичному изображению, полученному на шаге 1, для соединения разрозненных окрашенных частиц:
$$ A \ cdot B = (A \ oplus B) -B $$
A — двоичное входное изображение, B — круговой структурирующий элемент с заданным пользователем радиусом, а \ (A \ cdot B \) — результат фильтрации. {b} — 1 \, {\ rm {иначе}} \ end {array} $$
(5)
Пороговое изображение обрабатывается как двоичное изображение областей сегментации.Области фильтруются по размеру с помощью стандартного инструмента Particle Analysis от ImageJ. Области с площадью меньше заданного пользователем минимума (обведены красным на рис. 8) отбрасываются.
(6)
Наконец, результирующие области сегментации отображаются либо как маска двоичной сегментации, либо как прозрачное наложение поверх исходного изображения.
Рисунок 8
Конвейер сегментации для ImageJ. Плотные частицы, окрашенные Гольджи, обнаруживаются на изображении с помощью простой операции определения порога (1). Затем полученные дискретные объекты объединяются в смежные области с помощью операции морфологического закрытия (2). Чтобы сгладить эти области, применяется фильтр размытия по Гауссу (3), за которым следует вторая операция определения порога (4). Неспецифическое окрашивание удаляется путем сортировки сегментированных областей по площади и отбрасывания областей с площадью ниже заданного пользователем порога (5).Остальные области представляют собой результат сегментации и добавляются в качестве прозрачного канала к исходному стеку изображений (6). В качестве альтернативы они могут быть возвращены как стек масок двоичной сегментации.
Границы | Оценка методов окрашивания по граммам и жизнеспособности для количественной оценки динамики бактериального сообщества с использованием проточной цитометрии
Введение
Микробиота кишечника человека состоит из широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, археи, грибы, вирусы и дрожжи (Lozupone et al., 2012; Dieterich et al., 2018). Бактерии являются наиболее изученными микроорганизмами, их количество составляет около 10 ¹¹ на грамм стула и преобладают Firmicutes и Bacteroidetes (Qin et al., 2010). Анализ микробиоты кишечника привел к концепции энтеротипов, которые делят микробиоту человека на основе обогащения конкретных таксонов (Arumugam et al., 2011; Wu et al., 2011). На разнообразную и специфичную для каждого человека микробиоту кишечника могут влиять различные факторы, такие как возраст, пол, заболевания, лекарственные препараты, окружающая среда или питание (Lozupone et al., 2012). Было также показано, что ряд нарушений связан с измененным составом кишечной микробиоты (Lin and Zhang, 2017). Основываясь на этих наблюдениях, концепция пробиотиков следующего поколения (NGP) вызвала интерес. Он основан на использовании видов бактерий, принадлежащих к комменсальным родам, таким как Akkermansia , Christensenella или продуцентам бутирата Faecalibacterium , Roseburia и Eubacterium для восстановления равновесия кишечной микробиоты.Эти виды проявили потенциальный интерес благодаря противовоспалительным свойствам (Chang et al., 2019). Другая стратегия модуляции или коррекции дисбиотической микробиоты включает трансплантацию фекальной микробиоты (FMT), которая оказалась высокоэффективной при лечении рецидивирующих инфекций, вызванных Clostridioides difficile (Quraishi et al., 2017; Ianiro et al., 2018). Между тем, продолжается большое количество испытаний, изучающих другие потенциальные терапевтические применения (Allegretti et al., 2019).
Реакция сложных микробных сообществ на различные факторы, включая окружающую среду, образ жизни, пищевые привычки, пищевые добавки или лекарственные препараты, часто исследуется с использованием ферментационных систем in vitro (Geirnaert et al., 2017), состоящий из нескольких реакторов, имитирующих различные части желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (Williams et al., 2015). Молекулярные методы, основанные на кПЦР или секвенировании следующего поколения (NGS), обычно используются для анализа состава микробиоты кишечника. Обладая преимуществом обнаружения «некультивируемых» микроорганизмов, обычные технологии NGS обладают определенными недостатками, такими как необходимость ожидания в течение нескольких дней или даже недель перед получением отчетов, если секвенирование выполняется на аутсорсинге или выполняется платформой, или отсутствие метаболической активности. мониторинг.Это важное ограничение для ежедневного наблюдения за ферментацией или для исследования / оптимизации параметров культуры в экспериментальных и промышленных условиях. С другой стороны, о большом потенциале цитометрии как инструмента для быстрого анализа кишечной микробиоты сообщалось с момента ее разработки в 1990-х годах (van der Waaij et al., 1994). Его часто использовали в сочетании с флуоресцентно меченными зондами для нацеливания рРНК 16s, называемыми методом Flow-FISH (флуоресцентная гибридизация In situ ), для анализа состава кишечной микробиоты (Thomas et al., 2002; Мюллер и др., 2006). Этот аналитический инструмент все чаще используется в последние годы для анализа сложных экосистем, а также в качестве дополнительного инструмента к секвенированию для предварительного отбора образцов путем изучения концентраций микробных сообществ или мониторинга нежелательного бактериального роста (Perst et al., 2014). Сигналы прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) зависят от физических свойств анализируемых частиц и могут быть объединены с измерением автофлуоресценции для оценки изменений микробных сообществ без какого-либо окрашивания (Dhoble et al., 2016). Однако окрашивание образцов предлагает многопараметрический анализ, дающий более глубокую информацию об исследуемом сообществе (Buysschaert et al., 2016). В контексте бактериального анализа в основном используются окраски нуклеиновых кислот, а также лектины, меченые антибиотики или специфические красители для оценки мембранного потенциала или метаболической активности (Muller and Nebe-von-Caron, 2010). 4 ‘, 6-диамидино-2’-фенилиндол (DAPI), флуоресцентный краситель, который связывается с последовательностями двухцепочечной ДНК, богатыми AT, использовался в сочетании с FCM во многих приложениях и позволил идентифицировать конкретные подгруппы сложных сообществ в окружающей среде. образцы (Koch et al., 2013), кишечной микробиоты (Zimmermann et al., 2016) или микробиоты слюны (van Gelder et al., 2018). Совсем недавно Krause et al. (2020) использовали его, чтобы проследить динамику упрощенной микробиоты человека, состоящей из восьми видов бактерий, в ферментере. Однако использование DAPI требует УФ-лазера для возбуждения, который является дорогостоящим и, следовательно, менее доступным, чем другие лазеры. Таким образом, мы были заинтересованы в исследовании дополнительных методов окрашивания, которые предполагают использование более доступных лазеров, обычно используемых в проточных цитометрах.Другие окраски нуклеиновых кислот, включая Syto 9, SYBR Green I, а также Syto 24 и йодид пропидия (PI), часто используются для оценки жизнеспособности бактерий (Berney et al., 2007; Nescerecka et al., 2016; Chiron et al., 2018 ). Готовый к использованию набор Live / Dead ^® BacLight ^TM для определения жизнеспособности бактерий, сочетающий красители Syto 9 и PI, позволил быстро оценить жизнеспособность бактерий. Однако ранее при окрашивании ИП были получены вводящие в заблуждение результаты (Stiefel et al., 2015). Также были продемонстрированы другие стратегии, использующие комбинацию красителей нуклеиновых кислот Syto13 и гексидия йодида (HI) для идентификации грамположительных бактерий в смесях чистых культур (Mason et al., 1998). Методы окрашивания по Граму также были описаны с использованием агглютинина зародышей пшеницы (WGA), лектина, который связывается со специфическими углеводами (De Hoff et al., 2009), включая N -ацетилглюкозамин и N -ацетилнейраминовых остатков. в слое пептидогликана (Wittmann, Pieters, 2013). Лектин WGA также использовался для идентификации грамположительных бактерий в смешанных культурах известных бактерий (Ruger et al., 2012). Меченый ванкомицин также ранее использовался для подобных применений, включая анализ грамположительных бактерий из микробиоты кишечника мышей с помощью микроскопии (Wang et al., 2017). Этот антибиотик обладает способностью ингибировать синтез клеточной стенки путем связывания с C-концевыми остатками D-аланин-D-аланина предшественников пептидогликана (van Hoek et al., 2011), но молекула слишком велика, чтобы проникнуть через внешнюю мембрану Грамотрицательные бактерии (Fernandes et al., 2017).
Чтобы определить процедуры окрашивания, которые будут применимы к целому ряду микробных сред, это была особая потребность, выраженная во время семинаров конференции CYTO 2018 (Czechwska et al., 2019), мы исследовали использование специального метода окрашивания в сочетании с FCM для быстрой характеристики и мониторинга сложных экосистем, полученных в результате ферментации in vitro . Мы сосредоточились на окрашивании по Граму с комбинацией меченых WGA и ванкомицина и оценке соотношения живых / мертвых бактерий. Методы были разработаны и проверены на чистых культурах аэробных и факультативных или строго анаэробных бактерий перед их использованием в сложных экосистемах.
Материалы и методы
Этика
Фекальный материал был анонимно собран компанией MaaT Pharma у здоровых добровольцев.В соответствии со статьей L1243-3 Французского кодекса здравоохранения документы, описывающие коллекцию, были поданы под номером DC-2016-2609. Доноры были проинформированы о том, что никакая личная информация и анализ человеческого материала не будут проводиться и, как следствие, что никакая информация не может быть предоставлена относительно использования их пожертвований. Дело было принято французскими властями 15 мая 2016 года.
Бактериальные штаммы и питательные среды
Всего в экспериментах использовалось 54 штамма, включая 40 аэробных / факультативно-анаэробных штаммов и 14 строго анаэробных штаммов, соответствующих в общей сложности 20 видам.Аэробные штаммы культивировали при 37 ° C и перемешивании при 180 об / мин. Анаэробные комменсальные штаммы выращивали при 37 ° C с использованием анаэробной камеры (BACTRON 600 — Sheldon), заполненной атмосферой 90% N ₂ + 5% H ₂ + 5% CO ₂. Анаэробная атмосфера была подтверждена с помощью цветных индикаторов резазурина (BR0055 — Oxoid). Питательные среды, PBS и все другие материалы, используемые для культивирования, помещали в камеру по крайней мере за 48 часов до использования для снижения до анаэробных условий.
Среды
Brain heart Infusion (BHI) и Luria Berthani (LB) использовали для грамположительных и грамотрицательных аэробных / факультативных анаэробных штаммов.Модифицированная анаэробная среда Gifu (mGAM, Hyserve) использовалась для строго анаэробных штаммов и была дополнена либо 30% бычьего рубца (mGAMr), либо 0,1% целлобиозы, 0,1% инулина, 0,25% муцина и 30% рубца крупного рогатого скота (mGAM CRIM). Все штаммы и соответствующие им питательные среды представлены в таблицах 1, 2.
Таблица 1. Штаммы аэробных / факультативных анаэробных бактерий, питательные среды и грамм-статус.
Таблица 2. Штаммы строго анаэробных бактерий, питательные среды и грамм-статус.
Этикеточные пятна
Лектин Alexa-Fluor 647 ^® Агглютинин зародышей пшеницы (WGA-647 — Invitrogen — W32466) суспендировали в стерильной дистиллированной воде с получением исходного раствора с концентрацией 1 мг / мл. Исходный раствор ванкомицина Bodipy-FL (Van-Bodipy, Invitrogen — V34850) готовили в ДМСО в концентрации 0,5 мг / мл. Аликвоты обоих исходных растворов хранили при -20 ° C. Для анализа по Граму также использовали набор LIVE BacLight ^TM для бактериального окрашивания по Граму (Invitrogen — L7005), как рекомендовано производителем.Этот набор состоит из Syto 9 и HI в концентрации 3,34 и 4,67 мМ соответственно. Для анализа жизнеспособности использовали набор Live / Dead ^® BacLight ^TM для определения жизнеспособности бактерий (Invitrogen — L34856) в соответствии с рекомендациями производителя. Этот набор состоит из Syto 9 (3,34 мМ в ДМСО) и йодида пропидия (PI) (20 мМ в ДМСО), двух красителей нуклеиновых кислот, которые окрашивают все бактерии и, предпочтительно, бактерии с поврежденной клеточной стенкой, которые считаются «мертвыми, ”Соответственно (Berney et al., 2007).
Анализ проточной цитометрии
Сортировщик клеток Influx ^® (BD) был использован для цитометрического анализа. Он оснащен лазером 488 нм (мощность 200 мВт), лазером 405 нм (мощность 100 мВт) и лазером 640 (мощность 120 мВт) для получения сигналов прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC) на длине волны 488 нм. Флуоресценцию Syto 9, PI и HI возбуждали лазером 488 нм и собирали через полосовой фильтр 540/30 нм (BP) для Syto 9 и BP 670/30 нм для PI и HI. Компенсация не применялась при использовании Syto 9 и PI или Syto 9 и HI из-за низкого или даже отсутствия перелива флуоресценции, испускаемой в используемой полосе пропускания.Флуоресценцию Van-Bodipy возбуждали лазером 488 нм и собирали через BP 540/30 нм. Флуоресценцию WGA-647 возбуждали лазером 640 нм и собирали через BP 670/30 нм. При использовании двух разных лазеров для возбуждения Van-Bodipy и WGA-647 компенсация не применялась при использовании обоих красителей. Перед запуском образцов корректировка масштабирования площади и контроль качества выполнялись с помощью радужных шариков (Invitrogen — L34856), а скорость потока поддерживалась на уровне 100–150 событий в секунду.Анализ образцов проводился при скорости потока около 500–2000 событий / сек. Общее количество зарегистрированных частиц составило 50 000 событий.
Анализ данных и стробирование выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, США). Количественное определение бактерий проводили с использованием стандартных шариков микросфер (Invitrogen — L34856). Фоновый шум был устранен путем рассмотрения только событий со значениями FSC выше 10 ¹. Чтобы отличить клетки от фона в анализе жизнеспособности, использовали ворота для обнаружения бактерий.Только события с положительной флуоресценцией Syto 9 относились к бактериям (дополнительный рисунок S1). Для определения жизнеспособности ворота были установлены на основе обработанного изопропанолом контроля (дополнительный рисунок S1). Жизнеспособность рассчитывали как количество «жизнеспособных» клеток по отношению к общему количеству клеток («жизнеспособных» и «нежизнеспособных» клеток). Для доли Грама ручное стробирование выполнялось для видимых групп населения.
Оптимизация окрашивания по Граму в проточной цитометрии
Ночные культуры Bacillus subtilis ATCC 23857, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis Jh3.2, Lactococcus lactis ATCC 11454, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Salmonella enterica typhimurium ATCC 13311 и Escherichia coli ATCC 35218, оптическая плотность (OD ₆₀₀) была настроена на оптическую плотность (OD ₆₀₀). Ultrospec 10 cell Density), что соответствует 1,0 × 10 ⁸ до 1,0 × 10 ⁹ клеток на мл в зависимости от вида. Бактерии подвергались воздействию 1) 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2 или 4 мкг / мл Van-Bodipy, 2) равная смесь Van-Bodipy и немеченого ванкомицина (Van) в концентрации 1, 2, 4 и 8 мкг / мл или 3) 10, 20, 30, 50, 60, 80 или 100 мкг / мл конечных концентраций WGA-647 в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре.Комбинация обоих красителей Van-Bodipy / Van и WGA-647 также была исследована с их необходимыми концентрациями с 1 М KCl или без него, что, как было показано, улучшает окрашивание WGA-647 (Holm and Jespersen, 2003). Стадия промывки (центрифугирование при 10000 g в течение 5 минут) была добавлена для удаления несвязавшихся пятен. Образцы суспендировали в 200 мкл PBS и затем анализировали с помощью сортировщика клеток Influx ^®, как описано выше.
Влияние фиксации на окрашивание по Граму
Ночные культуры грамположительных и грамотрицательных бактерий доводили до OD ₆₀₀, равного 0.5 на основе измерения спектрофотометра. Культуры либо разбавляли PBS, либо 1 M KCl, а затем подвергали воздействию 1% параформальдегида (PFA) или 95% этанола в течение 1 ч при комнатной температуре. После двух стадий отмывки в PBS окрашивание обоими Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальной концентрации 2/2/20 мкг / мл затем выполняли либо в 1 M KCl, либо в PBS в течение 15 минут, в темноте при температуре окружающей среды. комнатная температура. Перед анализом FCM выполняли стадию промывки.
Скрининг по грамму аэробных / факультативных анаэробных штаммов и строго анаэробных бактерий
Ночные культуры были доведены до OD ₆₀₀, равного 0.5 для аэробных / факультативных анаэробных бактерий на основе измерений спектрофотометра или в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественного анализа проточной цитометрии для строго анаэробных бактерий. Использовали смесь Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 М KCl. После 15 мин окрашивания при комнатной температуре в темноте бактерии промывали PBS перед анализом FCM. Окрашивание проводили в трех биологических повторах.
Классическое окрашивание по Граму
кристаллическим фиолетовым и сафранином выполняли параллельно (набор для окрашивания 77730 по Граму, Sigma-Aldrich), и предметные стекла наблюдали с помощью 100-кратного масляного иммерсионного объектива.
Имеющийся в продаже набор LIVE BacLight ^TM для бактериального окрашивания по Граму, сочетающий Syto 9 и HI, использовали в соответствии с рекомендациями производителя для ночных культур E. coli BL21, E. faecalis ATCC 29212 и S. variabile DSM 15146 скорректирован в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии.
Оценка живого / мертвого окрашивания, анаэробная сортировка отдельных штаммов
Для оценки культивирования «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» фракций бактериальные клетки были отсортированы в соответствии с их статусом окрашивания «живые / мертвые», а затем культивированы в анаэробных условиях.Для этого сортировщик клеток Influx ^® был модифицирован, как описано ранее (Thompson et al., 2015). Вкратце, перчаточный ящик был подключен к сортировочной камере, создавая воздухонепроницаемую среду вокруг сортировочного потока. Азот продувался внутри перчаточного ящика для снижения концентрации кислорода ниже 0,8%, как показано датчиком ToxiRAE Pro (PGM-1860 — системы RAE).
Бактерии, использованные для экспериментов по сортировке, культивировали в анаэробных условиях в течение 24 или 48 часов при 37 ° C на чашках с mGAMr. Затем одну колонию субкультивировали в бульоне mGAMr или бульоне mGAM CRIM ( A.muciniphila и C. minuta ) в течение 24 часов на срок до 5 дней. Время культивирования определяли в зависимости от кинетики кривой роста каждого тестируемого штамма для достижения стационарной фазы и получения смеси клеток, окрашенных Syto 9 и Syto 9 / PI, позволяющей выполнить сортировку «жизнеспособных» и «нежизнеспособных». »Фракции. Бактерии были отрегулированы в диапазоне от 10 ⁷ до 10 ⁸ событий / мл на основе количественного анализа проточной цитометрии и окрашены в восстановленном PBS (0,5 мг / л резазурина, 2.1 мМ солидия серы и 2,8 мМ L -цистеин HCl) с Syto 9 и PI в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре при конечной концентрации 5 мкМ и 30 мкМ соответственно. Затем окрашенные образцы промывали и ресуспендировали в восстановленном PBS и покрывали 500 мкл парафинового масла для предотвращения воздействия кислорода перед анализом FCM. Предварительно восстановленную агаровую среду mGAMr, приготовленную в однолуночных планшетах Nunc OmniTray (Thermo Scientific), герметично закрывали в GenBag перед переносом из анаэробной камеры в перчаточный бокс сортировщика клеток.Сортировка производилась на этих пластинах с помощью модели 14 × 8, состоящей из 14 столбцов и 8 строк. Бактерии, окрашенные Syto 9 и Syto 9 / PI, сортировали в трех экземплярах, следуя схеме сортировки: 1, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 событий на пятно с функцией «одна капля — одна». Скорость потока была отрегулирована до 1000 событий / сек. По окончании сортировки чашки с агаром снова закрывали в GenBag перед переносом в анаэробную камеру на 24–48 ч инкубации при 37 ° C.
Среда для сбора образцов кала и ферментации
образцов стула были собраны анонимно у здоровых добровольцев, как указано в разделе «Этика».Основываясь на секвенировании репертуара гена 16S рРНК, три образца фекалий F1, F2 и F3, представляющие три описанных энтеротипа (Arumugam et al., 2011), были использованы для экспериментов по ферментации, выполненных со средой mGAM, традиционно используемой для культивирования комменсальных анаэробных бактерий (Gotoh et al., 2017) и ранее использовались в экспериментах по ферментации (Takagi et al., 2016).
Micro-24
^® Параметры микробиореактора и отбор проб
Периодическую ферментацию проводили в 24-луночной кассете Micro-24 ^® (MRT-PRC, Pall) с использованием специальных колпачков, позволяющих ограничить внешний газообмен.Культуральная среда и образцы фекалий F1, F2 и F3 обрабатывались в анаэробной камере. После добавления 5 мл культуральной среды в каждую независимую лунку кассеты проводили калибровку pH, как описано производителем. Вкратце, инкубацию кассеты только с культуральной средой в течение ночи проводили при 37 ° C при соответствующей подаче газа для поддержания анаэробных условий. Автономное измерение pH после инкубации было выполнено для расчета смещения, применяемого в управляющем программном обеспечении микробиореактора Micro-24 ^®.Затем в соответствующие лунки добавляли по 25 мкл каждого размороженного образца фекалий. Кассету Micro-24 ^® загружали в Micro-24 ^® и начинали ферментацию. Программное обеспечение Micro-24 ^® непосредственно контролирует pH, температуру и подачу газа. Каждый эксперимент проводили при 37 ° C, при орбитальном перемешивании со скоростью 650 об / мин и в анаэробных условиях, которые поддерживались подачей газа из смеси CO ₂ / N ₂ (75/25). PH регулировали на уровне 6.2 или 6.5 с питанием NH ₃.
Для каждого образца фекалий условия ферментации были выполнены в трех экземплярах. В каждый момент взятия образцов (24, 48 и 72 ч) собирали 500 мкл образцов для оценки количества, жизнеспособности и доли по Граму с помощью проточной цитометрии и выполнения анализа секвенирования. Анализ жизнеспособности и граммовой доли выполняли, как описано ранее, а количественную оценку выполняли с использованием стандартных микросфер (Invitrogen).
Экстракция ДНК, секвенирование и биоинформатический анализ
Образцы ферментации, собранные через 24 и 48 ч, были отобраны для секвенирования гена 16S рРНК.Геномная ДНК была экстрагирована Eurofins Genomics из образцов с использованием набора NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Библиотеку секвенирования, нацеленную на область V3-V4 гена 16S рРНК, конструировали для каждого образца с использованием MyTaq HS-Mix (Bioline) в соответствии с инструкциями производителя. Затем библиотеки секвенировали в прогонах MiSeq v3 (Illumina) с парными концами (2 × 300 п.н.). После объединения ампликонов с использованием FLASH (Magoc and Salzberg, 2011) чтения были отфильтрованы по качеству с помощью Trimmomatic (Bolger et al., 2014).Затем ампликоны были сгруппированы в OTU с порогом идентичности 97%, и каждому OTU была назначена таксономическая аннотация с помощью VSEARCH (Rognes et al., 2016) и базы данных Silva SSU Release 128. Для сравнения данных количество последовательностей был нормализован до 60 000 ампликонов на образец. Индексы α- и β-разнообразия были рассчитаны с использованием статистического программного обеспечения R (R Core Team, 2015, версия 3.4.4) с использованием пакетов Vegan и phyloseq. Для оценки изменчивости индексов α-разнообразия (богатства, Шеннона, обратного Симпсона) использовалось 20 подвыборок на выборку.Анализ главных координат β-разнообразия (PCoA) был создан с использованием меры несходства Брея-Кертиса. Секвенирование гена 16S рРНК проводили в трех повторах, за исключением двух образцов фекалий F2 и F3, полученных после 48 ч ферментации, при условии, что условия культивирования регулируются при pH 6,5, для которых анализ проводили на дубликатах.
Сравнение пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренных с помощью FCM, с пропорциями, оцененными на основе секвенирования репертуара 16S рРНК
Мы сравнили доли грамположительных и грамотрицательных бактерий, обнаруженных в сложной микробиоте, с использованием анализа FCM с предполагаемым отнесением по Граму каждой OTU на уровне рода (дополнительная таблица S1 для отнесения по Граму).Для профилирования микробиома использовались два разных расчета: классический подход относительной численности, описанный в разделе 2.11 этой рукописи, и количественный подход микробиома, описанный Vandeputte et al. (2017). В этом методе предлагается рассчитать глубину секвенирования с корректировкой числа копий гена 16S рРНК, разделенную на количество клеток в образце, чтобы учесть различия в количестве копий гена 16S рРНК между видами и различия в микробной нагрузке между образцами. Среднее количество оперонов было получено из базы данных rrndb (Stoddard et al., 2015) для каждой OTU на уровне рода, приближаясь к ближайшему филогенетическому уровню, когда род не был в базе данных (дополнительная таблица S1 для числа копий гена 16S рРНК, используемая для каждой OTU).
Статистический анализ
Все данные ферментации, включая цитометрию и секвенирование, выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.
Результаты
Оптимизация концентраций Van-Bodipy и WGA-647 для улучшения дифференциации по Граму
Были исследованы различные концентрации обоих меченых красителей Van-Bodipy и WGA-647 для определения наилучших условий окрашивания, позволяющих отличить грамположительные бактерии от грамотрицательных.Использовали ночные культуры B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis Jh3.2 и K. pneumoniae ATCC 700603, скорректированные до OD ₆₀₀ 0,5. Незначительные различия наблюдались на грамположительных бактериях с концентрациями 0,1 и 0,2 мкг / мл Van-Bodipy (данные не показаны). Окрашивание E. faecalis Jh3.2 улучшалось при постепенном увеличении концентраций Van-Bodipy с 0,5 до 4 мкг / мл со средними геометрическими значениями флуоресценции Van-Bodipy, увеличивающимися с 5 до 38.5, тогда как не было значительного улучшения для B. subtilis ATCC 23857, для которого средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy были лишь незначительно увеличены с 2,8 до 4,6 (рис. 1A). Грамотрицательные виды K. pneumoniae ATCC 700603 оставались неокрашенными Van-Bodipy, независимо от используемых концентраций, со средними геометрическими значениями флуоресценции Van-Bodipy около 1,1.
Рисунок 1. Оптимизация флуоресцентной маркировки для распознавания грамположительных и грамотрицательных бактерий.Были исследованы различные концентрации Van-Bodipy и WGA-647. Ночные культуры тестируемых бактерий B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis Jh3.2 и K. pneumoniae ATCC 700603 доводили до OD ₆₀₀ 0,5. Различные окрашивания проводили в течение 15 минут при комнатной температуре с различными концентрациями (A), Van-Bodipy, (B), Van-Bodipy / Van и (C) WGA-647. Более высокие концентрации представлены более темным серым цветом (A) 0.5; 1; 2 или 4 мкг / мл, (B) 1, 2, 4 и 8 мкг / мл и (C) 10, 20, 30, 50, 60, 80 или 100 мкг / мл конечные концентрации. Неокрашенные виды бактерий представлены черными пунктирными линиями.
Смеси равных количеств немеченого ванкомицина и Van-Bodipy были протестированы для улучшения окрашивания B. subtilis , как сообщалось ранее (Tiyanont et al., 2006). Были исследованы конечные концентрации Van-Bodipy / Van от 1 до 8 мкг / мл. Как ранее наблюдалось с одним только Van-Bodipy, окрашивание E.faecalis был улучшен с увеличением концентрации, средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились с 8,5 до 59,7 (рис. 1В). Однако эта стратегия не улучшила окрашивание ни для B. subtilis , ни для E. faecalis по сравнению с одним только Van-Bodipy. Поэтому процедура окрашивания использовалась как смесь Van-Bodipy / Van. Это позволило снизить количество меченого ванкомицина и сохранить эффективность окрашивания при той же конечной концентрации.При концентрации 4 мкг / мл Van-Bodipy, применяемый отдельно или в комбинации с немеченым ванкомицином, позволил получить средние геометрические значения флуоресценции для окрашивания E. faecalis , составляющие 34,5 и 38,5 соответственно.
Повышение концентрации WGA-647 с 10 до 100 мкг / мл немного улучшило окрашивание грамположительных бактерий (средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 увеличились с 8,0 до 22,9 и с 250,0 до 351,0 для B. subtilis ATCC 23857 и E. faecalis Jh3.2, соответственно), но также привело к увеличению окрашивания грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 увеличились с 1,0 до 1,5 (рис. 1C). Для остальных экспериментов использовали концентрацию 20 мкг / мл.
Комбинация Van-Bodipy / Van и WGA-647 с добавкой KCl Лучше дифференцировать грамположительные от грамотрицательных бактерий
Из-за слабого окрашивания B. subtilis различение грамположительных и грамотрицательных бактерий не было оптимальным.Комбинация обоих красителей, Van-Bodipy / Van и WGA-647, поэтому была исследована, и неокрашенные события представлены на Фигуре 2A. Было получено лучшее различение, но для B. subtilis сигнал флуоресценции все еще был близок к тому, который наблюдался для грамотрицательных бактерий (рис. 2В). Как описано Holm and Jespersen (2003), добавление 1 M KCl улучшило эффективность окрашивания, что привело к четкому различию между B. subtilis и грамотрицательными бактериями.Как окрашивание Van-Bodipy / Van, так и WGA-647 были улучшены для B. subtilis в присутствии 1 M KCl с увеличением среднего геометрического значения флуоресценции Van-Bodipy / Van и WGA-647 с 3,3. и от 9,7 до 11,7 и 93,3 соответственно (рис. 2C). Небольшое усиление окрашивания WGA-647 также наблюдалось для грамотрицательных бактерий, но разница оставалась значительной по сравнению с грамположительными бактериями.
Рисунок 2. Оптимизация различения грамположительных и грамотрицательных бактерий с добавлением KCl.Ночная культура тестируемых бактерий была доведена до OD ₆₀₀ 0,5. (A) Представлены неокрашенные виды бактерий. Окрашивание проводили комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 либо в присутствии (B), PBS, либо (C) 1 M KCl в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Грамположительные бактерии B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis ATCC 29212, L. lactis ATCC 11454 представлены красным, оранжевым и розовым цветом соответственно, а грамотрицательные бактерии K.pneumoniae ATCC 700603, S. enterica typhimurium ATCC 13311 и E. coli ATCC 35218 выделены зеленым, голубым и синим цветом соответственно. Каждый вид бактерий окрашивали отдельно и объединяли на одном участке FCM.
Методы фиксации PFA и этанола по-разному влияют на оптимизированный метод окрашивания
Чтобы определить, можно ли использовать метод окрашивания по Граму после фиксации образца, были исследованы два метода: 1% PFA и 95% этанол в течение 1 часа.Неокрашенные события и события, окрашенные в присутствии 1 M KCl, представлены на фигурах 3A, B, соответственно. Фиксация PFA не сильно повлияла на эффективность окрашивания тестируемых грамположительных бактерий (рис. 3C). Средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy / Van незначительно снизились с 62,3 до 41,7 и с 428,0 до 371,0 для B. subtilis и L. lactis соответственно, а средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 снизились с 126,0 до 77,4 и с 455,0 до 320,0 для B.subtilis и L. lactis соответственно. Эти вариации не изменили различия между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Было отмечено небольшое увеличение окрашивания грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились с 1,3, 1,1 и 2,1 до 1,6, 1,9 и 3,3 для E. coli , K. pneumoniae и S. enterica typhimurium соответственно. В отличие от PFA, фиксация 95% этанолом приводила к изменениям окрашивания, в основном для грамотрицательных бактерий, для которых средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван увеличились примерно с 1.2 для всех грамотрицательных бактерий до около 17,0 для S. enterica typhimurium и K. pneumoniae и около 22,0 для E. coli после фиксации этанолом (рис. 3D). Различие между грамположительными и грамотрицательными бактериями сохранилось, но этот метод фиксации следует использовать с осторожностью, поскольку он может привести к неправильной интерпретации в сочетании с окрашиванием Ван-Бодипи / Ван / WGA-647.
Рисунок 3. Влияние методов фиксации PFA и этанола на окрашивание по Граму.Ночная культура тестируемых бактерий была доведена до OD ₆₀₀ 0,5. (A) Представлены неокрашенные виды бактерий. Бактерии окрашивали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 в присутствии 1 М KCl перед фиксацией (B) или через 1 ч фиксации 1% PFA ( C) или 95% этанол (D) . Грамположительные бактерии B. subtilis ATCC 23857, E. faecalis ATCC 29212, L.lactis ATCC 11454 представлены красным, оранжевым и розовым цветом соответственно, а грамотрицательные бактерии K. pneumoniae ATCC 700603, S. enterica typhimurium ATCC 13311 и E. coli ATCC 35218 показаны зеленым светом. синий и синий соответственно. Каждый вид бактерий окрашивали отдельно и объединяли на одном участке FCM.
Различные штаммы одного вида окрашиваются по-разному WGA-647
Метод окрашивания, сочетающий Van-Bodipy / Van / WGA-647, был сначала валидирован с использованием 40 аэробных / факультативных анаэробных штаммов, принадлежащих к B.subtilis , E. faecalis , L. lactis , Staphylococcus aureus , E. coli , K. pneumoniae и S. enterica видов. Окрашивание Ван-Бодипи / Ван было одинаковым для всех протестированных штаммов, принадлежащих к одному виду (рис. 4). Грамотрицательные бактерии не окрашивались или окрашивались незначительно по сравнению с грамположительными бактериями. Средние геометрические значения флуоресценции Van-Bodipy / Van и WGA не превышали 4,0 и 2,5, соответственно, для всех испытанных грамотрицательных штаммов.Штаммы B. subtilis были наиболее слабо окрашенными среди грамположительных бактерий со средними геометрическими значениями флуоресценции Ван-Бодипи / Ван в диапазоне от 18,0 до 70,0 в зависимости от штамма. Для E. faecalis , S. aureus и L. lactis средние геометрические значения флуоресценции Ван-Бодипи / Ван составили около 366,0, 1463,0 и 183,0 соответственно. В отличие от окрашивания по Ван-Бодипи / Ван, штаммы по-разному реагировали на окрашивание WGA-647. Значительная изменчивость наблюдалась в пределах E.faecalis , для которых средние геометрические значения флуоресценции WGA-647 варьировались от 5,0 до 400,0, тогда как небольшие изменения наблюдались для S. aureus (от 260,0 до 600,0 со средним значением около 389,0), L. lactis (от 40,0 до 240,0) и B. subtilis (от 29,0 до 100,0). Таким образом, с помощью этого окрашивания грамположительные бактерии можно было легко отличить от грамотрицательных бактерий.
Рис. 4. Анализ проточной цитометрии с окрашиванием по Граму аэробных / факультативных анаэробных штаммов.Ночные культуры тестируемых бактериальных штаммов доводили до OD ₆₀₀ 0,5. Окрашивание проводили определенной комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 M KCl в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Каждый штамм окрашивали отдельно и объединяли на одном графике FCM. Окрашивание проводили в трех биологических повторностях, но на этом рисунке представлен только один из трех повторностей.
Тестирование метода окрашивания по Граму на нескольких строго анаэробных комменсальных штаммах
Чтобы определить, можно ли использовать комбинацию Van-Bodipy / Van / WGA-647 для строго анаэробных комменсальных штаммов, окрашивание оценивали с использованием выбора представляющих интерес видов.Окрашивание проводили в трех биологических повторах для каждого штамма (рис. 5). Верхний, средний и нижний ряды соответствуют видам бактерий, которые обычно описываются как грамположительные, грамотрицательные и грамотрицательные бактерии соответственно. Ожидается, что они будут окрашены (Gram +) и неокрашены (Gram-) при окрашивании Van-Bodipy / Van / WGA-647. Разработанное окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 позволило идентифицировать тестируемые виды как грамположительные бактерии, за исключением Clostridium scindens DSM 5676 (Рисунок 5B), который был лишь слегка окрашен Van-Bodipy / Van (средние геометрические значения флуоресценция 12.9 ± 1,0) и почти не окрашивается WGA-647 (средние геометрические значения флуоресценции 1,6 ± 0,1), что затрудняет дифференциацию от грамотрицательных бактерий. Гетерогенное окрашивание наблюдалось для Eubacterium hallii DSM 17630 (рис. 5А). Отдельно от окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647 на той же культуре выполняли окрашивание Live / Dead. Это позволило сопоставить популяцию, окрашенную Van-Bodipy / Van / WGA-647, которая была связана с «жизнеспособной» фракцией E.Hallii DSM 17630 культура. Аналогичный эффект произошел с E. hallii DSM 3353, и оценка в разные моменты времени выявила вариации окрашивания в зависимости от времени культивирования (дополнительный рисунок S2). Все флуоресцентное окрашивание соответствовало окрашиванию кристаллическим фиолетовым / сафранином, причем окрашивание более темным фиолетовым было получено как для штаммов E. hallii (рис. 5A и дополнительный рисунок S2), так и [ Ruminococcus ] крутящих моментов PCK 18 (рис. 5C) по сравнению с C.scindens (рис. 5В). Среди описанных грамположительных бактерий Subdoligranulum variabile можно классифицировать как грамположительные бактерии на основании окрашивания (фиг. 5L). Флуоресценция на длине волны излучения Ван-Бодипи соответствовала автофлуоресценции штамма, для которого среднее геометрическое значение составляло 11,3 ± 0,1. Флуоресценция не сильно увеличивалась при окрашивании по Ван-Бодипи / Вану со средним геометрическим значением 17,8 ± 0,5. На длине волны излучения WGA-647 автофлуоресценции не наблюдалось.И R.intechinalis (фиг. 5J), и Flavonifractor plautii PCK 48 (фиг. 5K) были слегка окрашены по Ван-Бодипи / Вану (средние геометрические значения флуоресценции 10,5 ± 1,2 и 10,7 ± 1,1 соответственно) и WGA- 647 (среднегеометрические значения флуоресценции 9,1 ± 1,6 и 3,5 ± 0,4 соответственно). Все протестированные грамотрицательные бактерии не окрашивались. Единственным исключением был Prevotella copri , окрашивание не позволило идентифицировать его как грамотрицательную бактерию, поскольку наблюдалась флуоресценция на длине волны излучения Ван-Бодипи, достигая среднего геометрического значения 12.5 ± 1,7 (данные не представлены).
Рис. 5. Окрашивание по Граму Van-Bodipy / Van / WGA-647 и кристаллическим фиолетовым грамположительных, грамотрицательных и грамотрицательных строго анаэробных бактерий. Верхний ряд соответствует культурам видов бактерий, описанных как грамположительные, включая (A) E. hallii DSM 17630, (B) C. scindens DSM 5676 (C) [ Ruminococcus ] крутящие моменты PCK 18 и (D) [ Clostridium ] spiroforme PCK 31.Средний ряд соответствует видам бактерий, описанных как грамотрицательные, включая (E) Akkermansia muciniphila DSM 22959, (F) Alistipes finegoldii DSM 17242, (G) Christensenella minuta (H) Bacteroides fragilis DSM 2151 и (I) Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079. Нижний ряд соответствует видам бактерий, описанным как грамм-переменная, включая (J) R.кишечник DSM 14610, (K) Flavonifractor plautii PCK 48 и (L) S. variabile DSM 15176. Все культуры были скорректированы в диапазоне от 10 ⁵ до 10 ⁷ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии. Окрашивание проводили определенной комбинацией Van-Bodipy / Van / WGA-647 при их оптимальных концентрациях 2/2/20 мкг / мл в 1 M KCl в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Окрашивание проводили в трех биологических повторах, и каждый из них объединяли на одном участке FCM.Параллельно те же культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым и сафранином, и предметные стекла наблюдали с помощью 100-кратного масляного иммерсионного объектива. Окрашивание кристаллическим фиолетовым каждого вида бактерий представлено на соответствующих графиках FCM.
Оценка живого / мертвого окрашивания чистых культур строго анаэробных комменсальных бактерий
Для оценки эффективности окрашивания «живые / мертвые» и его корреляции с культивированием была проведена анаэробная сортировка и культивирование анаэробных бактерий, окрашенных Syto 9 и PI, для нескольких представляющих интерес видов.Жизнеспособность культур сильно различалась в зависимости от рассматриваемых штаммов (дополнительный рисунок S3). Доля «жизнеспособных» бактерий снизилась до 40% через 2 дня культивирования для штаммов C. scindens и E. hallii , в то время как для R. ). Для B. fragilis , B. thetaiotaomicron и P. copri , культуры быстро достигли доли «жизнеспособных» бактерий менее 20% через 2 дня (дополнительный рисунок S3).Потребовалось от четырех до более чем 7 дней, чтобы наблюдать значительную смертность для других грамотрицательных видов, за исключением C. minuta , для которого примерно 95% бактерий все еще были помечены как «жизнеспособные» после 10 дней культивирования (дополнительный рисунок S3) . На основании этих жизнеспособностей P. copri , оба штамма E. hallii , B. thetaiotaomicron и B. fragilis были собраны через 24 часа культивирования; C. scindens и R. Кишечник между 24 и 48 часами и A.muciniphila , C. minuta , A. finegoldii и S. variabile через 5-7 дней культивирования. Эксперимент по сортировке проводили в трех биологических повторах для каждого штамма. Процент восстановления после сортировки был рассчитан для каждой отсортированной «жизнеспособной» — и «нежизнеспособной» окрашенной фракции на основании роста, наблюдаемого на культуральных чашках (фиг. 6A). Процент бактерий, культивируемых из «жизнеспособной» фракции, превышал 10% для всех видов, начиная с 12% для R.кишечник до 78% для C. minuta . Единственным исключением был для S. variabile , для которого менее 10% бактерий, отсортированных и культивированных из «жизнеспособной» фракции, позволяли расти колониям. Несколько колоний все еще культивировали из «нежизнеспособной» фракции, что соответствует примерно 0,1–3% отсортированных бактерий. Единственное исключение составил C. scindens , для которого ок. Были культивированы 10% бактерий, отсортированных из «нежизнеспособной» фракции (рис. 6В).
Рис. 6. Культивирование «жизнеспособных» — и «нежизнеспособных» окрашенных фракций. Культуры строго анаэробных бактерий, скорректированные в диапазоне от 10 ⁷ до 10 ⁸ событий / мл на основе количественной оценки проточной цитометрии, окрашивали Syto 9 и PI и затем сортировали на планшетах с mGAM. (A) Пример анаэробной сортировки «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» окрашенных фракций A. muciniphila и C. minuta . (B) Процент восстановления после сортировки «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» окрашенных фракций на основе окрашивания Live / Dead.Процент восстановления был рассчитан путем сообщения количества наблюдаемых колоний по сравнению с количеством ожидаемых отсортированных событий. Эксперименты по сортировке проводили по крайней мере в трех биологических повторностях. (C) Изображение ворот, используемых для сортировки различных строго анаэробных видов бактерий.
Эксперимент по ферментации
Чтобы определить, можно ли использовать метод окрашивания для отслеживания эволюции сложных экосистем во время процессов ферментации, этот метод был оценен на образцах, полученных в результате периодической ферментации различных образцов фекалий, выполненных в различных условиях культивирования.Три образца кала F1, F2 и F3 культивировали в микробиореакторе Micro-24 ^® в культуральной среде mGAM с pH, регулируемым на уровне 6,2 или 6,5. Концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне 0,01% во всей кассете во время ферментации. В наших экспериментах было трудно регулировать pH, с постоянным увеличением до 6,8 (F1 и F3) до 6,9 (F2) после 72 часов ферментации для условий pH 6,5 и от 6,4 (F1 и F3) до 6,5 (F2). для pH 6.2 (дополнительный рисунок S4).
Проточная цитометрия как первый уровень анализа сложных экосистем
Состав культивируемой фекальной микробиоты F1, F2 и F3 был проанализирован с помощью проточной цитометрии, которая позволила измерить количество бактерий и соотношение событий, окрашенных PI / Syto 9, что приблизительно соответствует общей жизнеспособности. Также оценивались грамположительные и грамотрицательные доли. После 24 часов ферментации жизнеспособность различных культивируемых материалов существенно не различалась, составляя около 70–85% для трех образцов фекалий, независимо от исходного состояния pH.Однако впоследствии потеря жизнеспособности была больше, особенно в условиях pH 6,5, когда через 72 часа ферментации наблюдалась менее 40% жизнеспособности (рис. 7).
Рис. 7. Изменение оценочной жизнеспособности во время ферментации. Жизнеспособность культивированных образцов фекалий измеряли с помощью проточной цитометрии в течение 72 часов ферментации. В каждый момент взятия образцов все образцы окрашивали Syto9 и PI. После 15 мин инкубации в темноте при комнатной температуре образцы анализировали методом проточной цитометрии и рассчитывали жизнеспособность для (A) F1, (B) F2 и (C) F3.
Бактериальная биомасса, измеренная с помощью количественного определения бактерий FCM, была обогащена на 1,9–2,2 логарифмических единиц в культурах объемом 5 мл по сравнению с исходными образцами фекалий после 48 часов ферментации. Окрашивание по Граму с помощью Van-Bodipy / Van / WGA-647 также выполняли непосредственно после отбора проб для отслеживания ферментации с точки зрения обогащения экосистем. После 24 ч ферментации точечные диаграммы FSC / SSC неокрашенных культур не показали различий между троекратными повторами для данной регуляции pH, но выявили четкую разницу между культурами при pH 6.2 и 6.5 для двух образцов кала F1 и F3 (дополнительные рисунки S5A, S7A). Большее количество групп было идентифицировано в культурах с pH 6,2, которые, как правило, оставались более похожими на их соответствующие исходные уровни по сравнению с культурами с pH 6,5. Окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 подтвердило различия, наблюдаемые между культурами с pH 6,2 и 6,5 для F1 и F3, с большим количеством групп, положительно окрашенных WGA-647, 1 и 2 группы, соответственно, в культурах с pH 6,2. по сравнению с культурами с pH 6,5 только с одной или отсутствующей группами, положительно окрашенными WGA-647 (дополнительные рисунки S5B, S7B).Разница была менее заметна для образца фекалий F2 на графиках FSC / SSC и Van-Bodipy / Van / WGA-647 (дополнительные рисунки S6A, S6B). В результате неокрашенные объекты были более представлены в культурах с pH 6,5 через 24 часа ферментации с пропорциями 68,5 ± 0,6% против 35 ± 1,9%, 63,7 ± 2,4% против 52,5 ± 1,2% и 81 ± 1,6% против 28,7 ± 1,4% для F1, F2 и F3 соответственно. Бактериальные сообщества не сильно изменились между 24 и 48 часами ферментации (дополнительные рисунки S5C, D, S6C, D, S7C, D).
Регулирование pH регулирует культивирование фекальной микробиоты во время периодической ферментации
Затем образцы анализировали на основе секвенирования гена 16S рРНК и сравнивали с соответствующими исходными уровнями. На уровне филумов и семей более низкая регуляция pH позволила лучше сохранить исходный состав фекальной микробиоты. Четыре доминирующих типа микробиоты кишечника: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria были представлены во всех культурах. Однако наблюдалась резкая амплификация Proteobacteria, при этом относительное количество связанных с Proteobacteria OTU достигало 20–30% и 40–60% после 48 часов культивирования при pH 6.2 и pH 6,5 соответственно (рисунок 8 и дополнительная таблица S2). После 24 часов ферментации и независимо от образца кала, Clostridiaceae 1 стали основным семейством типа Firmicutes, достигнув относительной численности около 60% (F1) и 50% (F3, F2) среди культур Firmicutes для культур с pH 6,5 ( Рисунок 8 и дополнительная таблица S2). В результате количество Lachnospiraceae и Ruminococcaceae , изначально доминировавших, было значительно снижено в этих культурах, достигнув менее 1% от Firmicutes.Семейства Lachnospiraceae и Ruminococcaceae лучше сохранялись в культурах с pH 6,2, но со значительным снижением их относительной численности по сравнению с исходными уровнями (Рисунок 8 и дополнительная таблица S2). Семейства типа Bacteroidetes относительно хорошо сохранились, за исключением семейства Prevotellaceae для F2, численность которого резко снизилась независимо от регулирования pH. Семейство Enterobacteriaceae доминировало над типом Proteobacteria и было примерно в два раза ниже по pH 6.2 культуры по сравнению с культурами с pH 6,5 (Рисунок 8 и дополнительная таблица S2).
Рис. 8. Относительные количества представлены на уровне семейства образцов фекалий F1, F2 и F3 после 24 и 48 часов ферментации, связанной с их цитометрическим анализом. Анализ проточной цитометрии представлен для (A) ферментации F1, (B) ферментации F2 и (C) ферментации F3. (D) Представлены результаты секвенирования гена 16S рРНК, представлены только семьи с относительной численностью более 1% в исходном состоянии или после ферментации.Данные представлены как среднее + стандартное отклонение для трех повторов, за исключением исходных значений.
Мы также рассмотрели α- и β-разнообразие культивируемых образцов на уровне OTU. Более низкая регуляция pH привела к богатству, аналогичному исходному, за исключением F3 (рис. 9A). Богатство даже превзошло базовые уровни после 48 часов брожения. Индексы Шеннона и Обратного Симпсона показали меньшее разнообразие культур по сравнению с исходными образцами фекалий, за исключением F2 в культурах с pH 6,2 после 24 часов ферментации (Фигуры 9B, C).В целом альфа-разнообразие было стабильным с течением времени.
Рис. 9. Полученные индексы α-разнообразия на уровне OTU (A) Richness (B) Индекс Шеннона (C) Обратный индекс Симпсона на основе секвенирования гена 16S рРНК.
Даже несмотря на то, что количество различных таксонов в культивируемых образцах фекалий в основном было сходным с их исходным уровнем, относительные количества не удалось сохранить, и культивируемые образцы фекалий показали несходства с соответствующими исходными данными (дополнительный рисунок S8A).Большее сходство с исходными линиями, измеренное с помощью индекса Брея-Кертиса на уровне рода, было получено в культурах с pH 6,2 независимо от исходного образца фекалий, около 30% для F1 и F3 и более 40% для F2 (дополнительный рисунок S8B). Сходство было относительно стабильным с течением времени.
Сравнение пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренных с помощью FCM, с пропорциями, оцененными на основе секвенирования репертуара 16S рРНК
Доли
грамположительных и грамотрицательных бактерий, измеренные с помощью FCM, сравнивали с пропорциями, рассчитанными с помощью анализа репертуара 16S рРНК с использованием двух разных методов.Значения R ², рассчитанные для кривых линейной регрессии, представлены на фиг. 10. Эти значения составляют 0,25 и 0,26, когда грамположительные и грамотрицательные пропорции, измеренные цитометрией, сравниваются с пропорциями, выведенными из классического анализа 16S рРНК. Они достигают 0,42 (грамотрицательный) и 0,90 (грамположительный), когда пропорции, измеренные при проточной цитометрии, сравниваются с пропорциями, выведенными из данных 16S рРНК после коррекции, основанной на количестве копий гена 16S рРНК и количестве клеток в образце (методы 2 .12; Vandeputte et al., 2017).
Рисунок 10. Корреляция пропорций грамположительных и грамотрицательных бактерий, оцененная с помощью секвенирования репертуара 16S рРНК и проточной цитометрии. Доли грамположительных и грамотрицательных бактерий, оцененные с помощью секвенирования гена 16S рРНК с использованием метода относительного или количественного профилирования микробиома (R- или QMP), сравнивали с пропорциями проточной цитометрии, оцененными с помощью метода окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647. Были получены кривые линейной регрессии и рассчитаны значения R ²: (A) корреляция между RMP и грамотрицательными бактериями.FCM, (B) корреляция грамположительных бактерий RMP против FCM, (C) корреляция грамотрицательных бактерий QMP против FCM и (D) корреляция грамположительных бактерий QMP против FCM.
Обсуждение
Изолированные штаммы, а также более или менее сложные смеси комменсальных штаммов все чаще исследуются в качестве возможных методов лечения большого количества патологий как у людей, так и у животных. Поэтому становится необходимым разработать инструменты, позволяющие отслеживать эволюцию этих экосистем, будь то в контексте НИОКР, направленных на изучение влияния различных параметров на эволюцию культурных популяций, или в промышленном контексте, чтобы контролировать производство интересующих штаммов.Технологии высокопроизводительного секвенирования предлагают высокий уровень точности для изучения филогенетического состава микробных популяций, но страдают определенными ограничениями: отсутствие измерения жизнеспособности бактерий, измерение относительной, а не абсолютной численности популяций, но, прежде всего, все еще относительно высокой стоимость и значительные задержки в получении результатов секвенирования.
В этом контексте FCM, адаптированный для бактериальных клеток, представляет собой интересную, быструю и экономичную технологию для быстрой оценки динамики сложных микробных экосистем и общей жизнеспособности их составляющих.По сравнению с анализом эукариотических клеток, анализ бактериальных клеток с использованием FCM все еще ограничен относительно небольшим количеством доступных флуоресцентных красителей. В основном используются красители нуклеиновых кислот, а также лектины, меченые антибиотики или специфические красители, позволяющие оценить мембранный потенциал или метаболическую активность (Muller and Nebe-von-Caron, 2010). В этом исследовании мы предложили оценить использование классического метода окрашивания Live / Dead, а также комбинации меченых WGA и ванкомицина в качестве внешних структурных красителей для идентификации и дифференциации грамположительных бактерий от грамотрицательных в сложных экосистемах.Оба метода окрашивания сначала оценивались на серии изолированных штаммов, включая строгие анаэробы, а затем использовались для отслеживания эволюции сложной микробиоты в процессе ферментации.
Было определено, что использование 4 мкг / мл Van-Bodipy / Van в сочетании с 20 мкг / мл WGA-647 в 1 М KCl является оптимальным условием окрашивания для дифференциации грамположительных бактерий от грамотрицательных. Как описано ранее, добавление 1 M KCl улучшало окрашивание некоторых грамположительных бактерий как WGA-647, так и Van-Bodipy / Van (Holm and Jespersen, 2003).KCl может дестабилизировать внешние структуры, в том числе тейхоевые кислоты, которые обычно жесткие в воде и меняют конфигурацию катушки на случайную в присутствии соли (Doyle et al., 1974), что приводит к большей доступности структур, признанных Ван -Бодипы / Ван и WGA-647. Фиксация 1% PFA может быть использована для отсрочки анализа образцов, поскольку отличия грамположительных бактерий от грамотрицательных бактерий не изменились. И наоборот, этанол мог вызвать растворение мембранных липидов, что привело к модификации третичных структур белков (Hobro and Smith, 2017) и разоблачению концевых цепей D-Ala-D-Ala пептидогликана, которые ранее были недоступны, что привело к усиленное окрашивание грамотрицательных бактерий.Скрининг окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647 был эффективным для различения различных грамположительных видов или даже штаммов бактерий, как это наблюдалось для E. faecalis . Бактерии, принадлежащие к этому виду, обнаруживают капсульные полисахариды (Hancock and Gilmore, 2002), определяющие различные серотипы на основе их разнообразия (Hufnagel et al., 2004; Thurlow et al., 2009). Будучи по-разному экспрессируемыми среди штаммов E. faecalis , такие капсулы могут маскировать структуры распознавания WGA и предотвращать его связывание с пептидогликаном.Лишь слабое окрашивание как Van-Bodipy / Van, так и WGA-647 наблюдалось для комменсальных анаэробных видов R.instinalis , F. plautii (PCK48) и C. scindens . Это не было полностью неожиданным для F. plautii и R. кишечника , которые первоначально были описаны как виды с грамм-переменной (Duncan, 2002; Carlier et al., 2010). C. scindens описан как грамположительный вид, но он обладает способностью образовывать споры, что может влиять на эффективность окрашивания.Окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 S. variabile , классифицирующее его как грамположительную бактерию, не согласуется с литературой, в которой S. variabile описывается как грамотрицательная окрашенная бактерия. Однако окрашивание с помощью коммерческого набора LIVE BacLight ^TM Bacterial Gram Stain Kit (Thermofisher), сочетающего Syto 9 и HI, последний предпочтительно маркирует грамположительные бактерии, также окрашивало S. variabile как грамположительные бактерии (дополнительный рисунок). S9).Окрашивание HI подтверждает классификацию S. variabile как монодермы Firmicutes (Megrian et al., 2020). Кроме того, штамм был чувствителен к ванкомицину с минимальной ингибирующей концентрацией 4 мг / л и содержит в своем геноме консервативные последовательности, кодирующие поверхностные белки мотивов лейцин-пролин-х-треонин-глицин (LPxTG), закрепленные на пептидогликане (ссылка последовательности WP_147644604.1 и WP_007048259.1) в грамположительных бактериях, что усиливает предыдущие результаты.Наконец, в наших экспериментах окрашивание Van-Bodipy / Van / WGA-647 было оптимизировано с использованием культуры, собранной в конце фазы логарифмического роста. Было бы интересно посмотреть на возможные варианты окрашивания в зависимости от стадии роста чистых бактериальных культур (Beveridge, 1990).
Окрашивание Live / Dead ^® BacLight ^TM уже использовалось другими для оценки соотношения «жизнеспособных» и «нежизнеспособных» бактерий в фекальной микробиоте с помощью проточной цитометрии с относительно хорошим соответствием между культивируемостью и FCM. результаты, когда образцы защищены от воздействия кислорода (Bellali et al., 2019; Burz et al., 2019). Однако также сообщалось, что окрашивание PI, включенное в набор, может вводить в заблуждение для конкретных видов бактерий, особенно когда бактерии собираются во время раннего экспоненциального роста и имеют высокий мембранный потенциал (Shi et al., 2007; Kirchhoff and Cypionka, 2017). Из-за этих ограничений мы были заинтересованы в оценке возможности культивирования фракций, определенных как «жизнеспособные» или «нежизнеспособные» с помощью набора для окрашивания Live / Dead ^® BacLight ^TM для нескольких строго анаэробных видов, представляющих интерес.В нашем исследовании наблюдалось до четырех популяций с разными уровнями окрашивания Syto 9 и PI в зависимости от тестируемых анаэробных видов (рис. 6C). Эти результаты не удивительны, поскольку промежуточные состояния, характеризующиеся разными уровнями окрашивания клеток Syto 9 и PI, уже были описаны другими (Berney et al., 2007). Анаэробная сортировка «жизнеспособных» фракций позволила культивировать более 10% отсортированных событий. Единственным исключением был для S. variabile , для которого автофлуоресценция в длине волны излучения Syto 9 могла, возможно, смещать анализ.Вводящие в заблуждение результаты были также получены для C. scindens , для которого наблюдался значительный рост отсортированной фракции, идентифицированной как «нежизнеспособная». C. scindens показал необычный образец окрашивания со слабым Syto 9 и слабым окрашиванием PI (фиг. 6C). Способность C. scindens образовывать споры, возможно, может быть причиной этих паттернов окрашивания, поскольку доступ к бактериальной ДНК затруднен из-за покрытия спор (Magge et al., 2009). Стоит отметить, что ИП потенциально может быть токсичным для бактерий и мог повлиять на результаты, полученные для отсортированных событий, окрашенных ИП.Поэтому при применении к сложным экосистемам следует с осторожностью подходить к анализу жизнеспособности, поскольку они представлены широким спектром видов бактерий, которые потенциально могут по-разному реагировать на окрашивание PI.
О резком распространении протеобактерий во время экспериментов по периодической ферментации уже сообщалось другими (Takagi et al., 2016; Sasaki et al., 2017; O’Donnell et al., 2018; Wiese et al., 2018). Более высокая относительная численность Proteobacteria была получена после 24 часов ферментации в нашем исследовании по сравнению с экспериментами по периодической ферментации, проведенными с той же культуральной средой mGAM и в тех же условиях pH (Takagi et al., 2016). Более важная амплификация Escherichia , наблюдаемая при pH 6,5 по сравнению с культурами pH 6,2, согласуется с исследованием Ilhan et al. (2017), которые показали преобладание этого рода в культурах, начинающихся при pH 6,5 и 6,9. Быстрорастущие, факультативные анаэробные виды бактерий, принадлежащие к этому роду, могут легко получить преимущество перед медленнорастущими облигатными анаэробами на начальных этапах ферментации, что может объяснить быстрое расширение изначально малочисленной популяции.Регулирование pH было ключевым фактором, влияющим на восстановление семейств и родов бактерий, которые всегда лучше сохранялись в условиях культивирования с pH, регулируемым на уровне 6,2, что согласуется с исследованием Walker et al. (2005), в которых лучшая сохранность представляющих интерес родов была получена при pH, регулируемом на уровне 5,5 по сравнению с 6,7. Три образца фекалий, использованные в эксперименте, эволюционировали по-разному во время ферментации, что привело к различиям в культивируемых семьях или родах. Влияние исходного сложного микробного сообщества было ранее продемонстрировано на культурах периодической ферментации (Perrotta et al., 2017; Van den Abbeele et al., 2018). Ферментация привела к различиям между культивируемыми образцами и исходными уровнями, явление, которое ранее наблюдалось в сопоставимой 24-луночной ферментационной системе in vitro (O’Donnell et al., 2018).
Оптимизированный метод окрашивания Van-Bodipy / Van / WGA-647 представляет собой первый уровень анализа сложных микробных экосистем, полученных при ферментации in vitro . Этот метод окрашивания выявил сильное сходство между популяционными сообществами, полученными для трех повторностей, а также резкое влияние условий pH на культуру бактериальных сообществ, что было дополнительно подтверждено секвенированием гена 16S рРНК (дополнительные рисунки S5, S6 и S7).В предыдущем исследовании FCM использовался для количественного пересчета относительной численности, полученной секвенированием гена 16S рРНК на основе количества бактерий (Vandeputte et al., 2017). Вместо того, чтобы уменьшать выходные данные до равного количества считываний для каждого образца, Vandeputte et al. (2017) преобразовали данные об относительной численности секвенирования в количественные профили микробиома, используя подсчет клеток в образцах. Интересно, что мы получили лучшие значения корреляции с измерениями FCM, когда этот подход, а не классический подход относительной численности, использовался для оценки долей в граммах на основе присвоения OTU Gram.Особенно это касалось грамположительных бактерий. Это наблюдение должно быть смягчено тем фактом, что эти анализы остаются потенциально сильно предвзятыми. Как наблюдается на чистых культурах, иногда трудно определить статус по Граму для конкретных видов / штаммов бактерий, и рискованно присвоить статус по Граму OTU, потенциально соответствующей нескольким видам, некоторые из которых никогда не культивировались и чей статус по Граму поэтому не известно. Значение числа оперонов 16S рРНК, используемых в качестве корректирующего фактора в подходе количественного профилирования микробиома, также очень подвержено систематическим ошибкам, поскольку это значение неизвестно для многих видов и может также варьироваться между штаммами (Louca et al., 2018). В этом контексте интересным анализом может быть сортировка подсообществ в соответствии с их статусом по Граму, измеренным с использованием FCM, а затем репертуара последовательности гена 16S рРНК отсортированных фракций, что планируется в будущих экспериментах.
Заключение
В нашем исследовании описывается быстрый и экономичный инструмент на основе FCM с использованием меченых WGA и ванкомицина, который можно использовать для быстрого создания моделей составных популяций сложных микробных экосистем, полученных с помощью ферментаций in vitro и .Это потенциально полезно в качестве экономичного инструмента, позволяющего отслеживать изменения во время процессов ферментации с целью выбора образцов, которые следует далее анализировать с помощью секвенирования. Эта комбинация окрашивания позволила дать общие тенденции эволюции данного образца. Мы также заметили, что набор жизнеспособности Live / Dead ^® BacLight ^TM был надежным инструментом для оценки жизнеспособности строго анаэробных комменсальных видов, испытанных в нашем исследовании, за заметным исключением двух видов, для которых автофлуоресценция и споруляция могут предвзятые результаты анализа.Эти предубеждения следует учитывать при анализе сложных микробных сообществ. В будущем FCM, используемый в сочетании с окрашиванием Van-Bodipy / Van / WGA-647, может стать первым аналитическим инструментом для оценки экосистем высокого уровня сложности, включая образцы комменсалов и окружающей среды. Метод окрашивания, вероятно, был бы улучшен, если бы его использовали в сочетании с другим окрашиванием, таким как ДНК-интеркалирующий краситель DAPI, который, как было показано, выявляет гетерогенность и динамические изменения кишечной микробиоты (Zimmermann et al., 2016), но требует использования УФ-лазера. FCM также может использоваться для определения пробиотиков с одним штаммом или сложных смесей бактерий, полученных в результате промышленной ферментации. Наконец, можно предположить, что FCM, вероятно, будет полезен для отслеживания эволюции четко определенной микробиоты в доклинических моделях животных, таких как модели гнотобиотических мышей (Brugiroux et al., 2016).
Заявление о доступности данных
Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в SRA / PRJNA609248 / https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA609248, FlowRepository / FR-FCM-Z2H9 / https: //flowrepository.org.
Авторские взносы
AD, SB, CS, JD и VT разработали концепцию экспериментов. AD выполнила все эксперименты по окрашиванию и ферментации. SB внесла свой вклад в эксперименты по окрашиванию. CG выполнила анализ и помогла интерпретировать данные секвенирования. AD и VT написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.
Конфликт интересов
AD, CG и CS работают в компании MaaT Pharma.
Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Финансирование
Эта работа была получена за счет инвестиций BIOASTER при финансировании программы «Investissement d’Avenir» французского правительства (грант № ANR-10-AIRT-03), а MaaT Pharma получила финансирование от Association Nationale Recherche Technologie через Convention Industrielle de Formation par la Recherche (CIFRE n ° 2016/1593).
Благодарности
Мы благодарим Шарлотту Миньон, а также Марин Анию и Мелани Нехлих за техническую помощь при установке и отборе проб для исследований ферментации соответственно. Мы благодарим Benoît Beitz за техническую помощь при анализе данных проточной цитометрии, советы и комментарии по улучшению этой рукописи. Мы также благодарим Адриена Виллэна за его помощь в биоинформатическом анализе. Наконец, мы благодарим Яна Байера за его полезные советы по развитию проточной цитометрии и Сесиль Шовель за помощь в анализе данных.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2020.01469/full#supplementary-material
Сноски
Список литературы
Аллегретти, Дж. Р., Маллиш, Б. Х., Келли, К., и Фишер, М. (2019). Эволюция использования трансплантации фекальной микробиоты и новые терапевтические показания. Ланцет 394, 420–431.DOI: 10,1016 / s0140-6736 (19) 31266-8
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Arumugam, M., Raes, J., Pelletier, E., Le Paslier, D., Yamada, T., Mende, D. R., et al. (2011). Энтеротипы микробиома кишечника человека. Природа 473, 174–180. DOI: 10.1038 / nature09944
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Беллали, С., Лагье, Дж. К., Рауль, Д., и Боу Халил, Дж. (2019). Среди живых и мертвых бактерий оптимизация сбора и обработки образцов остается важной для восстановления компонентов микробиоты кишечника. Фронт. Microbiol. 10: 1606. DOI: 10.3389 / fmicb.2019.01606
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Берни М., Хэммс Ф., Босхард Ф., Вейленманн Х. У. и Эгли Т. (2007). Оценка и интерпретация жизнеспособности бактерий с помощью набора LIVE / DEAD BacLight Kit в сочетании с проточной цитометрией. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 3283–3290. DOI: 10.1128 / AEM.02750-06
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Brugiroux, S., Beutler, M., Pfann, C., Garzetti, D., Ruscheweyh, H.J., Ring, D., et al. (2016). Геномно-управляемый дизайн определенной микробиоты мыши, которая придает устойчивость к колонизации против Salmonella enterica серовара Typhimurium . Нат. Microbiol. 2: 16215. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2016.215
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бурц С. Д., Абрахам А. Л., Фонсека Ф., Дэвид О., Шапрон А., Беге-Креспель Ф. и др. (2019).Руководство по обращению и хранению ex vivo образцов стула, предназначенных для трансплантации фекальной микробиоты. Sci. Rep. 9: 8897. DOI: 10.1038 / s41598-019-45173-4
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Buysschaert, B., Byloos, B., Leys, N., Van Houdt, R., and Boon, N. (2016). Переоценка многоцветной проточной цитометрии для оценки жизнеспособности микробов. Заявл. Microbiol. Biotechnol. 100, 9037–9051. DOI: 10.1007 / s00253-016-7837-5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карлье, Дж.П., Бедора-Фор, М., К’Уас, Г., Алаузет, К., Мори, Ф. (2010). Предложение об объединении Clostridium orbiscindens Winter et al. 1991 и Eubacterium plautii (Seguin 1928) Hofstad and Aasjord 1982, с описанием Flavonifractor plautii gen. нов., гребешок. nov., и переназначение Bacteroides capillosus на Pseudoflavonifractor capillosus gen. ноя, гребешок. ноя Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol. 60 (Pt 3), 585–590. DOI: 10.1099 / ijs.0.016725-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чанг, К. Дж., Лин, Т. Л., Цай, Ю. Л., Ву, Т. Р., Лай, В. Ф., Лу, К. С. и др. (2019). Пробиотики нового поколения в лечении болезней. J. Food Drug Anal. 27, 615–622. DOI: 10.1016 / j.jfda.2018.12.011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хирон, К., Томпкинс, Т. А., и Бургьер, П. (2018). Проточная цитометрия: универсальная технология для конкретной количественной оценки и оценки жизнеспособности микроорганизмов в пробиотических продуктах с множеством штаммов. J. Appl. Microbiol. 124, 572–584. DOI: 10.1111 / jam.13666
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чеховска, К., Ланниган, Дж., Ван, Л., Арчидиаконо, Дж., Эшхерст, Т. М., Барнард, Р. М. и др. (2019). Cyt-geist: текущие и будущие вызовы цитометрии: доклады семинаров конференции CYTO 2018. Cytom. А 95, 598–644. DOI: 10.1002 / cyto.a.23777
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Де Хофф, П.Л., Брилл, Л. М., и Хирш, А. М. (2009). Лектины растений: связи, которые связываются в симбиозе корней и защите растений. Мол. Genet. Геномика 282, 1–15. DOI: 10.1007 / s00438-009-0460-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дхобл, А.С., Бекал, С., Долатовски, В., Янц, К., Ламберт, К. Н., и Бхалерао, К. Д. (2016). Новый высокопроизводительный многопараметрический метод проточной цитометрии для мониторинга и быстрой характеристики динамики микробиома в анаэробных системах. Биоресурсы. Technol. 220, 566–571. DOI: 10.1016 / j.biortech.2016.08.076
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дойл, Р. Дж., МакДэннел, М. Л., Стрейпс, У. Н., Бердселл, Д. К., Янг, Ф. Э. (1974). Полиэлектролитная природа бактериальных тейхоевых кислот. J. Bacteriol. 118, 606–615. DOI: 10.1128 / jb.118.2.606-615.1974
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дункан, С. Х. (2002). Roseburia Кишечник sp.nov., новая сахаролитическая бактерия, продуцирующая бутират из фекалий человека. Внутр. J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 1615–1620. DOI: 10.1099 / 00207713-52-5-1615
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фернандес, М. М., Иванова, К., Хойо, Дж., Перес-Рафаэль, С., Франческо, А., и Цанов, Т. (2017). Нанотрансформация ванкомицина преодолевает внутреннюю резистентность грамотрицательных бактерий. ACS Appl. Матер. Интерф. 9, 15022–15030. DOI: 10.1021 / acsami.7b00217
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гейрнаерт, А., Калатаюд, М., Гроотерт, К., Лаукенс, Д., Девриз, С., Смагге, Г., и др. (2017). Бактерии, продуцирующие бутират, добавленные in vitro к микробиоте пациентов с болезнью Крона, увеличивают продукцию бутирата и улучшают целостность кишечного эпителиального барьера. Sci. Отчет 7: 11450. DOI: 10.1038 / s41598-017-11734-8
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гото, А., Нара, М., Сугияма, Ю., Саканака, М., Ячи, Х., Китаката, А. и др. (2017). Использование анаэробной среды Gifu для культивирования 32 доминирующих видов кишечных микробов человека и его оценка на основе профилей ферментации короткоцепочечных жирных кислот. Biosci. Biotechnol. Biochem. 81, 2009–2017. DOI: 10.1080 / 051.2017.1359486
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хэнкок, Л. Э., и Гилмор, М. С. (2002). Капсульный полисахарид Enterococcus faecalis и его связь с другими полисахаридами в клеточной стенке. Proc. Natl. Акад. Sci. США 99, 1574–1579. DOI: 10.1073 / pnas.032448299
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хобро, А. Дж., И Смит, Н. И. (2017). Оценка методов фиксации: пространственные и композиционные клеточные изменения, наблюдаемые с помощью рамановской визуализации. Vib. Spectrosc. 91, 31–45. DOI: 10.1016 / j.vibspec.2016.10.012
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Холм К. и Йесперсен Л. (2003). Метод проточно-цитометрического окрашивания по Граму для бактерий, ассоциированных с молоком. Заявл. Environ. Microbiol. 69, 2857–2863. DOI: 10.1128 / AEM.69.5.2857-2863.2003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hufnagel, M., Hancock, L.E., Koch, S., Theilacker, C., Gilmore, M.S, and Huebner, J. (2004). Серологическое и генетическое разнообразие капсульных полисахаридов у Enterococcus faecalis . J. Clin. Microbiol. 42, 2548–2557. DOI: 10.1128 / JCM.42.6.2548-2557.2004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Яниро, Г., Maida, M., Burisch, J., Simonelli, C., Hold, G., Ventimiglia, M., et al. (2018). Эффективность различных протоколов трансплантации фекальной микробиоты для инфекции Clostridium difficile: систематический обзор и метаанализ. United Eur. Гастроэнтерол. J. 6, 1232–1244. DOI: 10.1177/2050640618780762
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ильхан, З. Э., Маркус, А. К., Канг, Д. В., Риттман, Б. Э., и Б. Краймальник-Браун, Р. (2017). pH-опосредованные микробные и метаболические взаимодействия в фекальной обогащенной культуре. м Сфера 2: e0047-17. DOI: 10.1128 / mSphere.00047-17
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кирхгоф, К., Цыпионка, Х. (2017). Ион пропидия проникает в жизнеспособные клетки с высоким мембранным потенциалом во время окрашивания живых мертвецов. J. Microbiol. Методы 142, 79–82. DOI: 10.1016 / j.mimet.2017.09.011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кох, К., Гюнтер, С., Деста, А. Ф., Хюбшманн, Т., и Мюллер, С.(2013). Цитометрический дактилоскопический анализ для анализа вариаций микробной структуры внутри сообщества и определения функции субсообщества. Нат. Protoc. 8, 190–202. DOI: 10.1038 / nprot.2012.149
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Краузе, Дж. Л., Шепе, С. С., Фриц-Уоллас, К., Энгельманн, Б., Ролле-Кампчик, У., Кляйнштайбер, С. и др. (2020). После разработки сообществом SIHUMIx — новой модели кишечника in vitro для использования в биореакторах. Gut Microb. 1–14. DOI: 10.1080 / 194
.2019.1702431 [Epub перед печатью].
CrossRef Полный текст | PubMed Аннотация | Google Scholar
Лука С., Добели М. и Парфри Л. В. (2018). Коррекция количества копий гена 16S рРНК в исследованиях микробиома остается нерешенной проблемой. Микробиом 6:41. DOI: 10.1186 / s40168-018-0420-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лозупоне, К.А., Стомбо, Дж. И., Гордон, Дж.И., Янссон, Дж. К., и Найт, Р. (2012). Разнообразие, стабильность и устойчивость микробиоты кишечника человека. Природа 489, 220–230. DOI: 10.1038 / природа11550
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мэгге А., Сетлоу Б., Коуэн А. Э. и Сетлоу П. (2009). Анализ связывания красителя и мембранного потенциала в спорах видов Bacillus . J. Appl. Microbiol. 106, 814–824. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2008.04048.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мейсон, Д.Дж., Шанмуганатан С., Мортимер Ф. К. и Гант В. А. (1998). Флуоресцентный краситель по Граму для проточной цитометрии и эпифлуоресцентной микроскопии. Заявл. Environ. Microbiol. 64, 2681–2685. DOI: 10.1128 / aem.64.7.2681-2685.1998
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мегриан, Д., Тайб, Н., Витвиновски, Дж., Белойн, К., и Грибальдо, С. (2020). Одна или две мембраны? Diderm firmicutes бросает вызов разделению грамположительных / грамотрицательных. Мол. Microbiol. 113, 659–671.DOI: 10.1111 / mmi.14469
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Mueller, S., Saunier, K., Hanisch, C., Norin, E., Alm, L., Midtvedt, T., et al. (2006). Различия в фекальной микробиоте в разных европейских исследуемых популяциях в зависимости от возраста, пола и страны: кросс-секционное исследование. Заявл. Environ. Microbiol. 72, 1027–1033. DOI: 10.1128 / AEM.72.2.1027-1033.2006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мюллер, С., и Небе-фон-Карон, Г. (2010). Функциональные одноклеточные анализы: проточная цитометрия и сортировка клеток микробных популяций и сообществ. FEMS 34, 554–587. DOI: 10.1111 / j.1574-6976.2010.00214.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Nescerecka, A., Hammes, F., and Juhna, T. (2016). Конвейер для разработки и тестирования протоколов окрашивания для проточной цитометрии, продемонстрированный с помощью окрашивания SYBR Green I и йодидом пропидия. Дж.Microbiol. Методы 131, 172–180. DOI: 10.1016 / j.mimet.2016.10.022
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
О’Доннелл М.М., Ри М.С., Шанахан Ф. и Росс Р.П. (2018). Использование ферментационной системы мини-биореактора в качестве воспроизводимой высокопроизводительной периодической модели ex vivo дистального отдела толстой кишки. Фронт. Microbiol. 9: 1844. DOI: 10.3389 / fmicb.2018.01844
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Перротта, А.Р., Кумарасвами, Р., Бастидас-Оянедель, Дж. Р., Алм, Э. Дж. И Родригес, Дж. (2017). Состав посевного материала определяет микробное сообщество и функцию в анаэробном последовательном реакторе периодического действия. PLoS One 12: e0171369. DOI: 10.1371 / journal.pone.0171369
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Перст, Э. И., Эль-Чахтура, Дж., Хаммес, Ф., Сайкали, П. Э., ван Лосдрехт, М. К., и Фроувенвельдер, Дж. С. (2014). Сочетание проточной цитометрии и пиросеквенирования гена 16S рРНК: многообещающий подход к мониторингу и характеристике питьевой воды. Water Res. 63, 179–189. DOI: 10.1016 / j.watres.2014.06.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K. S., Manichanh, C., et al. (2010). Каталог микробных генов кишечника человека, созданный путем метагеномного секвенирования. Природа 464, 59–65. DOI: 10.1038 / nature08821
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кураиши, М. Н., Видлак, М., Бхала, Н., Мур, Д., Прайс, М., Шарма, Н. и др. (2017). Систематический обзор с метаанализом: эффективность трансплантации фекальной микробиоты для лечения рецидивирующей и резистентной инфекции Clostridium difficile. Aliment Pharmacol. Ther. 46, 479–493. DOI: 10.1111 / apt.14201
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ругер, М., Бенш, Г., Танглер, Р., и Райхл, У. (2012). Метод проточной цитометрии для оценки жизнеспособности Staphylococcus aureus и Burkholderia cepacia в смешанной культуре. Cytom. А 81, 1055–1066. DOI: 10.1002 / cyto.a.22219
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сасаки К., Сасаки Д., Окаи Н., Танака К., Номото Р., Фукуда И. и др. (2017). Таурин не влияет на состав, разнообразие или метаболизм микробиоты толстой кишки человека, моделируемой в системе однократной ферментации. PLoS One 12: e0180991. DOI: 10.1371 / journal.pone.0180991
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ши, Л., Гюнтер, С., Хубшманн, Т., Вик, Л.Ю., Хармс, Х., и Мюллер, С. (2007). Пределы йодида пропидия как индикатора жизнеспособности клеток экологических бактерий. Cytom. А 71, 592–598. DOI: 10.1002 / cyto.a.20402
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Штифель П., Шмидт-Эмрих С., Маниура-Вебер К. и Рен К. (2015). Критические аспекты использования тестов жизнеспособности бактериальных клеток с флуорофором SYTO9 и иодидом пропидия. BMC Microbiol. 15:36. DOI: 10.1186 / s12866-015-0376-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Стоддард С. Ф., Смит Б. Дж., Хайн Р., Роллер Б. Р. и Шмидт Т. М. (2015). rrnDB: улучшенные инструменты для интерпретации изобилия генов рРНК у бактерий и архей и новая основа для будущего развития. Nucleic Acids Res. 43, D593 – D598. DOI: 10.1093 / nar / gku1201
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такаги, Р., Сасаки, К., Сасаки, Д., Фукуда, И., Танака, К., Йошида, К., и др. (2016). Система однократной ферментации для имитации микробиоты толстой кишки человека для высокопроизводительной оценки пребиотиков. PLoS One 11: e0160533. DOI: 10.1371 / journal.pone.0160533
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Thomas, V., Rochet, V., Boureau, H., Ekstrand, C., Bulteau, S., Dore, J., et al. (2002). Молекулярная характеристика и пространственный анализ упрощенной микробиоты кишечника, демонстрирующей устойчивость к колонизации против Clostridium difficile . Microb. Ecol. Health Dis. 14, 203–210. DOI: 10.1080 / 08
0310002082
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Томпсон, А. В., Кроу, М. Дж., Уэди, Б., Аренс, К., Туркарслан, С., Столяр, С. и др. (2015). Метод анализа, сортировки и сохранения жизнеспособности облигатных анаэробных микроорганизмов из сложных микробных сообществ. J. Microbiol. Методы 117, 74–77. DOI: 10.1016 / j.mimet.2015.07.009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Терлоу, Л.Р., Томас, В. К., и Хэнкок, Л. Е. (2009). Продукция капсульного полисахарида в Enterococcus faecalis и вклад CpsF в сероспецифичность капсулы. J. Bacteriol. 191, 6203–6210. DOI: 10.1128 / JB.00592-09
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тиянонт К., Доан Т., Лазарус М. Б., Фанг X., Руднер Д. З. и Уокер С. (2006). Визуализация биосинтеза пептидогликана в Bacillus subtilis с флуоресцентными антибиотиками. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 11033–11038. DOI: 10.1073 / pnas.0600829103
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван ден Аббеле, П., Таминиау, Б., Пинейро, И., Дуйсбург, К., Джейкобс, Х., Пейлс, Л., и др. (2018). Арабиноксилоолигосахариды и инулин влияют на индивидуальные вариации на метаболизм и состав микробов, которые иммуномодулируют клетки человека. J. Agric. Food Chem. 66, 1121–1130. DOI: 10.1021 / acs.jafc.7b04611
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
ван дер Ваай, Л.А., Месандер, Г., Лимбург, П. К., и ван дер Ваай, Д. (1994). Прямопроточная цитометрия анаэробных бактерий в кале человека. Цитометрия 16, 270–279. DOI: 10.1002 / cyto.9312
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
van Gelder, S., Rohrig, N., Schattenberg, F., Cichocki, N., Schumann, J., Schmalz, G., et al. (2018). Цитометрический подход для отслеживания изменений и динамики микробиоты слюны. Методы 134-135, 67–79. DOI: 10.1016 / j.ymeth.2017.08.009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
ван Хук, А. Х., Мевиус, Д., Герра, Б., Маллани, П., Робертс, А. П., и Аартс, Х. Дж. (2011). Приобретенные гены устойчивости к антибиотикам: обзор. Фронт. Microbiol. 2: 203. DOI: 10.3389 / fmicb.2011.00203
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Vandeputte, D., Kathagen, G., D’Hoe, K., Vieira-Silva, S., Valles-Colomer, M., Sabino, J., et al.(2017). Количественное профилирование микробиома связывает изменчивость кишечного сообщества с микробной нагрузкой. Природа 551, 507–511. DOI: 10.1038 / природа24460
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уокер, А. У., Дункан, С. Х., Мак-Вильям Лейтч, Э. К., Чайлд, М. У. и Флинт, Х. Дж. (2005). pH и поступление пептидов могут радикально изменить популяции бактерий и соотношение короткоцепочечных жирных кислот в микробных сообществах толстой кишки человека. Заявл. Environ. Microbiol. 71, 3692–3700. DOI: 10.1128 / AEM.71.7.3692-3700.2005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван В., Чжу Ю. и Чен X. (2017). Селективная визуализация грамотрицательных и грамположительных микробиот в кишечнике мышей. Биохимия 56, 3889–3893. DOI: 10.1021 / acs.biochem.7b00539
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Визе, М., Хакимов, Б., Нильсен, С., Соренсен, Х., ван ден Берг, Ф., и Нильсен, Д.С. (2018). CoMiniGut — небольшая модель толстой кишки in vitro для скрининга процессов микробной ферментации кишечника. PeerJ 6: e4268. DOI: 10.7717 / peerj.4268
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уильямс, К. Ф., Уолтон, Г. Э., Цзян, Л., Пламмер, С., Гараиова, И., и Гибсон, Г. Р. (2015). Сравнительный анализ моделей кишечного тракта. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6, 329–350. DOI: 10.1146 / annurev-food-022814-015429
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ву, Г.D., Chen, J., Hoffmann, C., Bittinger, K., Chen, Y.Y., Keilbaugh, S.A., et al. (2011). Связь долгосрочных диетических моделей с кишечными микробными энтеротипами. Наука 334, 105–108. DOI: 10.1126 / science.1208344
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zimmermann, J., Hübschmann, T., Schattenberg, F., Schumann, J., Durek, P., Riedel, R., et al. (2016). Проточная цитометрия микробиоты с высоким разрешением выявляет динамические изменения бактериального состава фекалий, связанные с колитом. Eur.